鄭百利，劉承惠，徐靜怡，李冰

(錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

鴿新城疫是一種以腹瀉和神經(jīng)紊亂為主要特征的病毒性傳染病[1]。其病原是一種抗原變異的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)，又稱禽副黏病毒Ⅰ型(paramyxovirus 1，APMV-1)[2]。1978年在中東地區(qū)首次分離到了鴿源禽副黏病毒Ⅰ型，隨后傳播到北非、歐洲等地，不久該病毒迅速傳播至世界各地[3]。1985年我國首次在香港分離到鴿副黏病毒，隨后廣東、福建、四川等多省份相繼出現(xiàn)鴿副黏病毒的相關(guān)報道[4-5]。鴿新城疫的流行給對我國肉鴿和賽鴿的飼養(yǎng)都造成了嚴重的經(jīng)濟損失，該病成為威脅養(yǎng)鴿業(yè)的重要疫病之一[6]。

NDV屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒亞科(Avulavirinae)、正禽腮腺炎病毒屬(Orthoavulavirus)[7]，基因組為單股負鏈不分節(jié)段的RNA病毒，包含6個結(jié)構(gòu)基因，按照3′-NP-P-M-F-HN-L-5′的順序編碼結(jié)構(gòu)蛋白，另外還有2個非結(jié)構(gòu)蛋白(V和W)[8]。根據(jù)全基因組序列長度不同，將NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類，其中ClassⅠ類毒株基因組全長15 198 nt，ClassⅡ類毒株為15 186 nt或15 192 nt。NDV只有1個血清型，但根據(jù)F蛋白全基因序列和最新分類命名體系， ClassⅠ類NDV僅有1個基因型(含3個亞型)；ClassⅡ類毒株至少可分為20個基因型和48個亞型[9]。禽副黏病毒分為9個血清型，即APMV-1～9，引起鴿發(fā)病的毒株多數(shù)屬于APMV-1型。另外，APMV-7型也可在鴿群中流行，并引起火雞和鴕鳥發(fā)病[10]。雖然引起鴿發(fā)病的副黏病毒F蛋白上具有強毒株特點的胰蛋白酶裂解位點，但是鴿副黏病毒對雞的致病力弱，甚至沒有致病力[11]。2017年4—6月，遼寧地區(qū)某賽鴿公棚幼齡鴿陸續(xù)發(fā)生疑似ND病例，發(fā)病率約20%，病鴿主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲下降、排綠色水樣稀便、頭頸歪斜；剖檢病鴿可見腦部水腫、消化道黏膜輕微出血。本研究對遼寧地區(qū)分離的鴿副黏病毒進行全基因測序，并將其與國內(nèi)外典型的毒株進行序列比對，分析遺傳演化特點，為遼寧地區(qū)鴿源禽副黏病毒Ⅰ型的分子流行病學(xué)研究提供有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

鴿副黏病毒遼寧分離株由錦州醫(yī)科大學(xué)畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全重點實驗室分離保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程有限公司；血液總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；2×TaqMaster Mix(含染料)購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取及cDNA的合成

按RNA快速提取試劑盒使用說明，從細胞培養(yǎng)物中提取總RNA，并按常規(guī)反轉(zhuǎn)錄方式進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中鴿副黏病毒毒株P(guān)i/SH/CH/0168/2013(登錄號：KT163263)設(shè)計16對引物，對分離病毒的全基因序列進行擴增，引物信息詳見表1，由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 全基因引物信息

序號引物名稱產(chǎn)物長度/bp上游引物(5'→3')下游引物(5'→3')位置退火溫度/℃1APMV516516ACCAAACAGAGAATCTGTGAGT-TACGGTAAAGGGCGCTATCACCATGAATCTCTGTGCT1～51658.22APMV10341 034GCCCCAGTTCAACAACAGTTGCCACTGCTCTCATCA454～1 48756.13APMV14191 419TGGACCTGATGAGAGCAGTGGCCGGTTGCGAGAGCTTATTGAGTGTC1 464～2 88260.24APMV604604GAGACCCATCCCTTTACGTGACGATCCTGTATTGTGGGGTGATTCG2 821～3 42558.55APMV11141 114TGTGAATTCATGGACTCATCTAGGAGAGTCGACTTACTTCTTAAAGG-GAT3 296～4 39055.06APMV636636GTACTCGGACCCTCTGTGCTTGTGGAGCAACTTGACTATGATTGACCCT4 112～4 74858.47APMV16951 695GCCGGCACATCCAAAGTGCAATATCTCGTCGGCATTCATGTTCTTGTAG4 528～6 19857.18APMV793793GGTTAGCAGAGAGTAACAGCAAACTGCTATTGTTTGCAGCCCCATTAATC5 988～6 78056.09APMV11651 165GTCTCTAAGGTGGAAGACAAGAT-TACCTGGCCGGGTGAAGGCATTAAATGT6 604～7 76856.010APMV13201 320GAAACCTAATTCGCCCAGCGACACTGGACCTCAATACTTGACAGTTCTTC7 377～8 69656.311APMV11711 171GGACGGGCAGTGCATCAGACTCTCTGGTGACAGGGTCATAGTCTATAC8 603～9 77356.212APMV11801 180GCCACGAGTCAAGACAGATACGATGTCTGACCTGATGGTTTCACGAT9 622～10 80156.613APMV13561 356GCATGGTACAAGGTGACAATCAGGTGAGTCTTTGACCCAAGATACGGCAC10 623～11 97857.314APMV12401 240GATACCATAGAACTTGTGGAGGGAGGAGTGCAAGAGACTAACAATTTCGC11 807～13 04656.015APMV13731 373GCTACAATTTCTCACCCCATCATTCGTAGGCCCGCCTAAATAGCCCAT-GAC12 917～14 28956.616APMV10111 011GTTCACTCCGTGTTCCACAAAAG-GATACCAAACAAAGATTTGGTGAATGA-CAGGAC14 182～15 19256.5

1.2.3 全基因序列的擴增及克隆測序

采用RT-PCR方法對全基因序列進行分段擴增。按照常規(guī)方法進行反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)體系(30 μL)：模板cDNA 3 μL；引物2 μL(上下引物各1 μL)；dH2O 10 μL；2×TaqMaster Mix 15 μL，按照表1中退火溫度對16條引物進行擴增，擴增出目的條帶后純化PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，涂于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)皿上進行篩選，培養(yǎng)16 h后挑取單個菌落，經(jīng)PCR驗證為陽性，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，放于-20 ℃保存，每個樣品重復(fù)3次，將所提質(zhì)粒送至上海生物科技有限公司進行測序。

1.2.4 全基因序列比對分析

測序結(jié)果經(jīng)NCBI-BLAST比對正確后，根據(jù)各片段之間相互重疊的區(qū)域，用DNAman拼接獲得完整的基因序列。采用MEGA 7.0和DNAStar 7.0軟件將分離毒株的F蛋白、M蛋白和全基因序列與GenBank中公布的代表性毒株的基因序列及氨基酸序列進行同源性比對，并制作進化樹；參照文獻[9]提出的新城疫病毒分類命名體系對分離毒株進行分型。用于比對分析的序列信息見表2。

表2 全基因序列比對分析的代表毒株序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧分離株全基因各片段PCR擴增

利用RT-PCR方法擴增出了鴿副黏病毒遼寧分離株全基因各片段，產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段與預(yù)期片段大小基本一致，電泳結(jié)果見圖1。

2.2 測序結(jié)果及全基因序列的拼接

根據(jù)測序結(jié)果重疊區(qū)域用DNAman進行拼接、校正，經(jīng)BLAST驗證得到鴿源禽副黏病毒Ⅰ型全基因序列，命名為LNPPMV17。分離毒株全基因序列共15 192個核苷酸，有6個結(jié)構(gòu)蛋白，各結(jié)構(gòu)蛋白的具體位置詳見表3。將鴿源禽副黏病毒Ⅰ型遼寧分離毒株LNPPMV17的全基因序列提交GenBank，經(jīng)檢驗后獲得登陸號MK335466。

M1、M2、M3. DL2000 DNA marker；1～16. PCR產(chǎn)物

表3 遼寧分離株LNPPMV17結(jié)構(gòu)蛋白基因信息

基因起始位置5'非編碼區(qū)編碼框位置3'非編碼區(qū)終止位置NP56～6566122～1 5912171 798～1 808P1 810～1 819831 893～3 0801803 250～3 260M3 262～3 271343 296～4 3901124 493～4 503F4 504～4 513464 550～6 211846 285～6 295HN6 327～6 336916 418～8 1331958 318～8 328L8 376～8 385118 387～15 0017715 079～15 088

2.3 基于F蛋白基因序列分析

LNPPMV17遼寧分離株F基因全長1 792 bp，開放閱讀框的長度為1 662 bp，編碼553個氨基酸。分離毒株F0裂解位點的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，第116位氨基酸為精氨酸(R)，符合禽副黏病毒特點，第112位點、113位點、115位點均為堿性氨基酸，并且第117位氨基酸為亮氨酸(F)，符合強毒株特征，詳見圖2。

圖2 遼寧分離株F0裂解位點的氨基酸序列

用DNAStar 7.0軟件對遼寧分離株LNPPMV17與32個國內(nèi)外參考毒株的F蛋白全基因序列進行比較，分離毒株與19株鴿源副黏病毒核苷酸同源性在91.8%～98.7%之間，與9株雞源副黏病毒的同源性在82.7%～87.2%之間，與4株其他禽類副黏病毒的同源性68.7%～84.6%之間。用MEGA 7.0軟件對F蛋白全基因序列進行分析并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，鴿源副黏病毒遼寧分離株與Qinghai株(MG840656)同源關(guān)系最近，核苷酸同源性為98.7%，核苷酸距離僅為1.4%(小于5%)。根據(jù)傳統(tǒng)的基因分型方法，LNPPMV17分離株屬于ClassⅡ類新城疫病毒，基因型為Ⅵ型，基因亞型為 k亞型；根據(jù)最新分類命名系統(tǒng)，LNPPMV17分離株屬于Ⅵ.2.1.1.2.2，詳見圖3。

2.4 基于M蛋白氨基酸分析

遼寧分離株M蛋白基因全長1 240 nt，其開放閱讀框長度1 095 nt，編碼364氨基酸。運用DNAStar 7.0軟件對LNPPMV17分離株的氨基酸序列與32個參考毒株進行同源性分析，遼寧分離株與參考株氨基酸同源性為88.5%～98.6%。氨基酸同源性比較分析發(fā)現(xiàn)：鴿源副黏病毒M蛋白第36位點氨基酸殘基為精氨酸(R)，其他禽類均為谷氨酰胺(Q)；另外，鴿源副黏病毒第68位點氨基酸殘基為異亮氨酸(I)，其他禽類均為纈氨酸(V)，詳見圖4。推測M蛋白第36位、68位氨基酸可能是禽副黏病毒Ⅰ型在鴿宿主體內(nèi)進化、適應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸。

框內(nèi)是根據(jù)文獻[10]提出的最新分類命名標(biāo)準(zhǔn)查詢指南對現(xiàn)有新城疫毒株的基因分型結(jié)果，中括號右邊是2012年以來的分類方式

圖3 F蛋白全基因序列系統(tǒng)進化樹

圖4 M蛋白氨基酸比對結(jié)果

2.5 遼寧分離株全基因序列分析

2.5.1 遼寧分離株全基因序列同源性分析

運用DNAStar 7.0軟件對遼寧分離株LNPPMV17的全基因核苷酸序列與GenBank下載的32個參考毒株基因序列進行同源性分析。遼寧分離株與參考株的全基因核苷酸同源性為71.7%～98.7%，其中遼寧分離株與19株鴿源副黏病毒同源性為91.8%～98.7%，同源性在95%以上的有11株，與Qinghai株同源性最高(98.7%)；與9株雞源副黏病毒同源性為82.8%～87.3%；與其他禽類副黏病毒同源性為71.7%～84.6%。根據(jù)同源性比對分析結(jié)果，分離株與水禽的同源性較低，與鴨NDV08-004株同源性僅為71.7%。

2.5.2 基于全基因序列的系統(tǒng)進化分析

根據(jù)遼寧分離株LNPPMV17與32個參考毒株的全基因序列，應(yīng)用MEGA 7.0軟件(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖5可以看出，ClassⅠ群毒株與ClassⅡ群毒株的遺傳關(guān)系較遠，分別形成單獨的分支，此結(jié)果與F基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹一致；鴿源副黏病毒均在同一條分枝上，且親緣關(guān)系較近，該結(jié)果與F基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果基本一致，基因Ⅵ型中的亞型均在同一分支上，但核苷酸同源性略有差異；遼寧分離株LNPPMV17與Qinghai毒株的親緣關(guān)系最近，其次為國內(nèi)分離的Shanghai、SDLC毒株，而與疫苗株Lasota、Clone30的親緣關(guān)系較遠。

圖5 基于各毒株全基因序列的系統(tǒng)進化樹

3 討論

禽副黏病毒有9個血清型，能引起鴿發(fā)病的主要是禽副黏病毒Ⅰ型(APMV-1)，APMV-7型在鴿群中也有流行，并可引起火雞和鴕鳥暴發(fā)感染。1996—2005年Liu等[12]從中國分離到14株鴿源禽副黏病毒Ⅰ型，其中10株屬于基因Ⅵb型，3株屬于基因Ⅶ型，1株是疫苗毒屬于基因Ⅱ型。郭虹波[13]對2010—2012年從中國吉林、廣東、遼寧、黑龍江分離到的8株鴿源禽副黏病毒Ⅰ型分析表明，8株均屬于基因Ⅵb型。2015年王林等[14]從北京分離到1株鴿副黏病毒(BJP13)，遺傳進化分析結(jié)果表明BJP13屬于基因Ⅵb型。本試驗從遼寧地區(qū)分離1株鴿源禽副黏病毒Ⅰ型，基因組全長15 192 nt，符合ClassⅡ病毒特征；根據(jù)F蛋白全基因序列遺傳進化分析表明，分離毒株屬于基因Ⅵ型，并且F0裂解位點的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，符合目前我國鴿源禽副黏病毒Ⅰ型特點；根據(jù)全基因序列分析表明，遼寧分離株LNPPMV17與Qinghai株親緣關(guān)系最近，同源性為98.7%。由此可見，遼寧分離株LNPPMV17屬于新城疫ClassⅡ類病毒，基因型為Ⅵ型。

M蛋白是一種核質(zhì)穿梭蛋白，在NDV復(fù)制周期中起定位作用[15]。目前研究發(fā)現(xiàn)鴿副黏病毒M蛋白第36位氨基酸為R，其他禽類副黏病毒均為Q；同時，構(gòu)建了R→Q的變異毒株，發(fā)現(xiàn)變異毒株在鴿體內(nèi)復(fù)制能力和致病力明顯下降[16]，推測禽副黏病毒Ⅰ型在鴿體內(nèi)適應(yīng)過程中，出現(xiàn)的獨特氨基酸突變，也可能與宿主特異性有關(guān)。本試驗分離的LNPPMV17毒株M蛋白第36位氨基酸也是R，與32個參考毒株進行氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)第68位氨基酸為Ⅰ，其他禽類均為V。由此可見，鴿源禽副黏病毒Ⅰ型M蛋白第36位、68位氨基酸的差異可以作為區(qū)別其他禽類副黏病毒Ⅰ型的標(biāo)志。

近年來，遼寧省養(yǎng)鴿業(yè)發(fā)展迅速，特別是肉鴿、賽鴿養(yǎng)殖量較大。由于養(yǎng)殖量的增加與鴿的流通頻繁，鴿新城疫的危害越來越嚴重。雖然鴿源禽副黏病毒Ⅰ型與雞新城疫病毒同屬一個血清型，但分別屬于2個不同的適應(yīng)毒株，因此單純用雞新城疫疫苗免疫不能有效保護鴿免受鴿源禽Ⅰ型副黏病毒的感染[17]。遼寧分離株與疫苗Lasota株、Clone 30株全基因組同源性僅為83%，這可能是影響雞新城疫疫苗對鴿保護效率不高的重要因素之一。另外，通過鴿源禽副黏病毒Ⅰ型全基因序列比對分析發(fā)現(xiàn)，與遼寧分離株同源性在98%以上的有6個病毒株，分別源于青海、上海、山東、安徽、云南和四川。由此可見，我國流行的鴿源禽副黏病毒Ⅰ型同源性較高，可能是近年來賽鴿也迅速發(fā)展，鴿流通增加而導(dǎo)致的。