陳濤，倪建秀，陳桂芳，李文杰

(南京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測院，江蘇 南京 210036)

氯霉素(chloramphenicol,CAP)、甲砜霉素(thiamphenicol,TAP)、氟苯尼考(florfenicol,FF)均屬于酰胺醇類藥物，具有廣譜抗菌性，對革蘭陽性和革蘭陰性菌都具有抑制作用，因此在畜禽養(yǎng)殖中常被用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染[1-3]。然而，研究發(fā)現(xiàn)氯霉素對人類的造血系統(tǒng)有明顯的毒性作用，可引起再生障礙性貧血，甲砜霉素則會(huì)抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的生成，而氟苯尼考具有胚胎毒性[4-5]。因此為了避免此類藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留給人類健康造成危害，在世界各國，該類藥物的使用都受到嚴(yán)格的限制。歐盟關(guān)于獸藥殘留的(EU)No 37/2010號法規(guī)和我國農(nóng)業(yè)部235號公告都規(guī)定氯霉素為禁用藥物，甲砜霉素的最高殘留限量為50 μg/kg(蛋雞產(chǎn)蛋期為禁用)，氟苯尼考在雞肉中的最高殘留限量為100 μg/kg，在豬肉中為300 μg/kg(蛋雞產(chǎn)蛋期為禁用)。氟苯尼考胺(florfenicol amine,FFA)是氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)代謝的主要產(chǎn)物[6]，因此農(nóng)業(yè)部235號公告將其作為標(biāo)志殘留物計(jì)算氟苯尼考?xì)埩袅?，而歐盟(EU)No 37/2010號法規(guī)中氟苯尼考?xì)埩袅渴且苑侥峥及泛头侥峥細(xì)埩艨偭坑?jì)。

目前該類藥物的檢測方法主要有液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、毛細(xì)管電泳法[12]、酶聯(lián)免疫法等[13]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，得到廣泛應(yīng)用。Xie等[14]采用乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V)混合溶液提取、正己烷去脂后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，對雞蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺進(jìn)行定量檢測，取得良好的回收率和精密度結(jié)果。Barreto等[9]選擇乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)作為提取溶劑，對禽肉、豬肉、牛肉和魚肉中的4種酰胺醇類藥物進(jìn)行定量檢測，提取物經(jīng)正己烷去脂后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示在牛肉基質(zhì)中4種化合物的回收率范圍為82%～108%。

酰胺醇類藥物作為一類廉價(jià)、高效的抗生素在畜禽養(yǎng)殖中有著廣泛的使用，但不規(guī)范、不合理甚至非法用藥的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此需要建立一種可同時(shí)檢測多種畜禽產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的準(zhǔn)確、穩(wěn)定的定量檢測方法，對此類藥物在畜禽產(chǎn)品中的殘留進(jìn)行監(jiān)控。目前國內(nèi)畜禽產(chǎn)品中酰胺醇類藥物殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)大多只檢測氟苯尼考原型而未檢測其代謝產(chǎn)物，且同時(shí)檢測禽蛋、禽肉和豬肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)的報(bào)道較少。曾勇等[15]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽蛋和禽肉中酰胺醇類藥物殘留，未包括豬肉基質(zhì)。本文使用經(jīng)過優(yōu)化的提取溶劑和固相萃取(SPE)步驟，進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，最終方法檢出限可達(dá)0.1 μg/kg，為同時(shí)檢測雞蛋、雞肉和豬肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留建立了一種靈敏度高、穩(wěn)定性好的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考對照品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；氟苯尼考胺對照品購自德國Witega公司；氘代氯霉素(氯霉素-d5)、氘代氟苯尼考(氟苯尼考-d3)對照品購自加拿大TRC公司；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮為色譜純，購自美國TEDIA公司；乙酸銨、甲酸、乙酸為色譜純，購自美國Sigma-aldrich公司；試驗(yàn)用水為Millipore系統(tǒng)所制超純水。

精密稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇各自配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后精密量取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液適宜體積，用甲醇配制成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。同時(shí)精密量取氯霉素-d5和氟苯尼考-d3內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液適宜體積，用甲醇配制成1.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于-20 ℃保存。

1.2 樣品處理

提取：稱取2.00 g(精確至0.01 g)試樣于 50 mL聚丙烯離心管中，加入1.0 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL,再加入乙腈∶氨水(98∶2，V/V)溶液10 mL，于渦旋混合器上混合1 mim后振蕩20 min,以4 ℃，10 000 r/min,離心5 mim,取上清液，再向沉淀中加入10 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次,合并2次提取上清液，40 ℃水浴中氮吹至近干，然后用5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，V/V)溶液復(fù)溶待用。

凈化：將復(fù)溶后的提取液全部轉(zhuǎn)移至經(jīng)5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，V/V)溶液活化的CNW Si SPE柱中，擠干后用5 mL丙酮∶正己烷(6∶4，V/V)溶液洗脫，洗脫液在40 ℃水浴中氮吹至近干。用1 mL乙腈∶水(3∶7，V/V)溶液溶解，再加入2 mL正己烷，4 000 r/min,離心10 mim,取下層過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 超高效液相色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，前端連接ACQUITY UPLC CSH保護(hù)柱(5 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為mmol/L乙酸銨乙腈溶液。梯度洗脫：0.2～6 min,5% B～60% B, 6～7 min, 60% B～95% B, 7～8 min, 維持95% B, 8～8.1 min, 95% B～5% B, 8.1～9.5 min,維持5% B,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量5 μL，流路在1～6 min之間進(jìn)入質(zhì)譜，在1 min之前和6 min之后切向廢液，柱溫為40 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源ESI；0～2.5 min,進(jìn)行正離子模式掃描(氟苯尼考胺)，2.5～9.5 min，進(jìn)行負(fù)離子模式掃描(氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5、氟苯尼考-d3)，霧化氣壓力為414 kPa,氣簾氣壓力為207 kPa,輔助加熱氣壓力為345 kPa，碰撞氣設(shè)置為Medium,以上4種氣體均為氮?dú)?，離子源溫度為600 ℃，正離子化電壓為4 500 V，負(fù)離子化電壓為-4 500 V，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集模式，優(yōu)化后的4種化合物及2種內(nèi)標(biāo)物的檢測離子、對應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種化合物及2種內(nèi)標(biāo)物的檢測離子、對應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)

名稱母離子/(m·z-1)子離子/(m·z-1)去簇電壓/V碰撞電壓/eV氟苯尼考胺248.0230.1*12015130.012028氟苯尼考356.0336.0*-100-14185.1-100-25氯霉素321.1152.1*-85-23256.9-85-15甲砜霉素353.9289.9*-85-16184.9-85-26氟苯尼考-d3359.0188.0*-130-25氯霉素-d5326.0157.0*-120-23

注：*表示定量子離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用針泵直接進(jìn)樣方式，對50 ng/mL的氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正離子模式下母離子全掃描，確定其分子離子峰，同樣方式對50 ng/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5、氟苯尼考-d3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行負(fù)離子模式下母離子全掃描，確定其分子離子峰，然后以這些分子離子作為母離子進(jìn)行子離子全掃描，選擇其中響應(yīng)水平較高且干擾較小的2個(gè)子離子分別作為定量和定性離子，最后優(yōu)化其去簇電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果詳見表1。

2.1.2 液相色譜條件優(yōu)化

嘗試選擇含不同濃度乙酸銨的水和乙腈溶液作為流動(dòng)相，最終發(fā)現(xiàn)乙酸銨為2 mmol/L時(shí)，氟苯尼考胺可以在C18柱上獲得足夠保留時(shí)間，各化合物的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度也較好，同時(shí)在添加基質(zhì)后，目標(biāo)物出峰處沒有明顯雜峰干擾(見圖1～3)，最終選擇含2 mmol/L乙酸銨的水和乙腈溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

選擇乙腈、乙酸乙酯、乙腈∶氨水(98∶2，V/V)、乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)、乙腈∶乙酸乙酯∶氨水(49∶49 ∶2，V/V)作為提取溶劑，并比較了在不同提取溶劑間進(jìn)行組合提取后的回收率，結(jié)果顯示乙腈∶氨水(98∶2，V/V)提取1次后再使用乙酸乙酯提取1次，4種化合物的添加回收率整體較好，結(jié)果詳見圖4～6。

在凈化環(huán)節(jié)，本文比較了BoundElut-C18、Oasis MCX、Oasis HLB 和CNW Si 4種SPE柱對雞蛋、雞肉和豬肉3種基質(zhì)的凈化效果，最終選擇使用CNW Si小柱，其去除干擾雜質(zhì)效果較好，4種化合物整體回收率較高。

2.2 線性和靈敏度

精密量取酰胺醇類標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用空白基質(zhì)提取液稀釋成含有各化合物濃度分別為0.2、1.0、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(氟苯尼考-d3、氯霉素-d5內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng/mL)，依次進(jìn)樣，將測得的峰面積比值與對應(yīng)濃度比值擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在0.2～100 ng/mL范圍內(nèi)，各化合物在不同基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，結(jié)果見表2。

向空白試樣中逐級添加4種化合物，以獲得的各目標(biāo)化合物的定量離子峰信噪比≥3時(shí)的最低添加濃度為該化合物的方法檢測限，以信噪比≥10時(shí)的最低添加濃度為該化合物的方法定量限。結(jié)果表明，在雞蛋、雞肉和豬肉中，酰胺醇類4種化合物的檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。

2.3 回收率和精密度

向空白試樣中添加0.5、1.0、2.0 μg/kg的3個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度6個(gè)平行，按照1.2方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)行3次，空白基質(zhì)樣品和空白基質(zhì)添加樣品色譜圖見圖7及圖1-3。結(jié)果顯示，本方法在0.5～2.0 μg/kg添加范圍內(nèi)，回收率范圍為70.6%～112.3%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～12.7%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～14.5%，結(jié)果見表3。

A. 空白雞蛋基質(zhì)中添加2.0 μg/kg的4種化合物和5.0 μg/kg的2種內(nèi)標(biāo)物總離子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

圖1 空白雞蛋基質(zhì)中添加酰胺醇類藥物色譜

A.空白雞肉基質(zhì)中添加2.0 μg/kg的4種化合物和5.0 μg/kg的2種內(nèi)標(biāo)物總離子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

圖2 空白雞肉基質(zhì)中添加酰胺醇類藥物色譜

A.空白豬肉基質(zhì)中添加2.0 μg/kg的4種化合物和5.0 μg/kg的2種內(nèi)標(biāo)物總離子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

圖3 空白豬肉基質(zhì)中添加酰胺醇類藥物色譜

圖4 雞蛋中4種化合物不同提取條件下回收率

圖5 雞肉中4種化合物不同提取條件下回收率

圖6 豬肉中4種化合物不同提取條件下回收率

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

向空白試樣提取液中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制成5 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)溶液，與同濃度溶劑加標(biāo)溶液進(jìn)行比較，設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行重復(fù)進(jìn)樣2次，記錄目標(biāo)化合物峰面積。試驗(yàn)結(jié)果表明在不同基質(zhì)中氟苯尼考胺等4種化合物和氟苯尼考-d3等2種內(nèi)標(biāo)物都表現(xiàn)出一定程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中氟苯尼考胺和甲砜霉素在3種基質(zhì)中表現(xiàn)出的基質(zhì)效應(yīng)較弱，而氟苯尼考和氯霉素在3種基質(zhì)中則有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，同時(shí)作為內(nèi)標(biāo)物的氟苯尼考-d3和氯霉素-d5除在雞蛋中基質(zhì)效應(yīng)不顯著外，在另外2種基質(zhì)中則有明顯基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)存在,具體結(jié)果見表4。

2.5 實(shí)測樣品

對從南京地區(qū)部分養(yǎng)殖場、屠宰場抽取的雞蛋、雞肉和豬肉樣品各10份進(jìn)行檢測，并同時(shí)由質(zhì)控人員向3種空白基質(zhì)中隨機(jī)添加4種化合物進(jìn)行盲樣添加試驗(yàn)，最終30份樣品中未檢出氟苯尼考等4種藥物， 1份雞肉盲樣中檢出氯霉素0.48 μg/kg(添加量為0.5 μg/kg)，1份雞蛋盲樣中檢出氟苯尼考1.56 μg/kg(添加量為1.5 μg/kg)，盲樣檢測回收率與2.3添加回收試驗(yàn)結(jié)果相符合，說明該方法適用于雞蛋、雞肉和豬肉中酰胺醇類藥物檢測。

表2 空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

空白基質(zhì)化合物名稱標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性范圍/(μg?L-1)相關(guān)系數(shù)/r雞蛋氟苯尼考胺y=0.341 05x+0.003 110.2～1000.995 5氟苯尼考y=0.837 18x+0.004 820.2～1000.995 8氯霉素y=0.745 92x+0.004 800.2～1000.998 7甲砜霉素y=0.219 81x+0.000 170.2～1000.996 8雞肉氟苯尼考胺y=0.396 35x+0.016 720.2～1000.992 9氟苯尼考y=1.166 08x+0.002 290.2～1000.996 5氯霉素y=0.776 11x+0.001 080.2～1000.997 9甲砜霉素y=0.175 74x+0.011 390.2～1000.995 2豬肉氟苯尼考胺y=0.480 42x+0.002 730.2～1000.996 4氟苯尼考y=0.877 19x+0.005 610.2～1000.995 7氯霉素y=0.817 61x+0.004 730.2～1000.996 7甲砜霉素y=0.182 17x+0.001 280.2～1000.996 6

表3 空白基質(zhì)中添加4種化合物回收率及精密度

空白基質(zhì)化合物名稱添加濃度/(μg?kg-1)回收率/%批內(nèi)RSD(n=6)/%批間RSD(n=3)/%氟苯尼考胺0.570.69.89.81.072.88.57.92.073.46.35.2氟苯尼考0.598.712.76.81.0107.27.110.4雞蛋2.0101.52.68.9氯霉素0.5108.54.312.41.0105.69.27.62.0110.411.311.5甲砜霉素0.574.51.510.91.078.52.74.82.083.91.83.6氟苯尼考胺0.575.45.36.41.079.27.211.22.076.68.58.7氟苯尼考0.5105.73.35.61.0112.33.64.9雞肉2.0109.64.03.2氯霉素0.5108.33.912.61.096.75.37.52.098.94.14.7甲砜霉素0.594.29.213.11.095.35.310.42.094.76.46.9氟苯尼考胺0.580.57.94.71.086.78.810.82.084.910.67.6氟苯尼考0.5103.15.33.31.0107.53.44.8豬肉2.0108.46.24.5氯霉素0.592.69.86.11.0105.45.712.82.0110.72.511.3甲砜霉素0.580.68.714.51.085.85.210.32.087.16.68.4

表4 不同基質(zhì)中4種化合物及2種內(nèi)標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)

化合物名稱雞蛋雞肉豬肉氟苯尼考胺1.041.031.04氟苯尼考1.301.521.51甲砜霉素1.061.091.03氯霉素1.251.811.75氟苯尼考-d30.941.531.60氯霉素-d51.111.281.45

3 討論

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5和氟苯尼考-d3的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有鹵素原子和羥基基團(tuán)，具有高電負(fù)性，在質(zhì)譜負(fù)離子掃描模式下獲得的靈敏度較高，氟苯尼考胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有氨基基團(tuán)，在正離子模式下靈敏度較高[14]。因此在一次進(jìn)樣中要同時(shí)進(jìn)行正、負(fù)兩種離子模式的質(zhì)譜掃描，此時(shí)流動(dòng)相的選擇對不同目標(biāo)物的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度有著重要影響。在流動(dòng)相中添加甲酸或乙酸，可以提高正離子模式掃描下的氟苯尼考胺的響應(yīng)強(qiáng)度，改善其峰形，但是對采用負(fù)離子模式掃描的其他5種化合物則會(huì)產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)[16]。選擇不添加任何物質(zhì)的水和乙腈作為流動(dòng)相，可以在正、負(fù)兩種離子掃描模式下獲得較好的響應(yīng)強(qiáng)度，但此時(shí)極性相對較強(qiáng)的氟苯尼考胺在C18柱上保留則會(huì)較弱，系統(tǒng)死體積內(nèi)就會(huì)被洗脫下來。本文最終選擇含2 mmol/L乙酸銨的水和乙腈溶液作為流動(dòng)相，使各化合物能夠獲得良好色譜分離和響應(yīng)強(qiáng)度。

乙腈或乙酸乙酯對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率較高[14-19]。但由于氟苯尼考胺是一種弱堿性物質(zhì)，堿性環(huán)境中會(huì)更利于其在液液萃取中分配于有機(jī)相中，因此在選擇提取溶劑時(shí)，需要考慮性質(zhì)不同的所有目標(biāo)化合物的提取效率。本文最終選擇乙腈∶氨水(98∶2，V/V)提取1次后再使用乙酸乙酯提取1次，4種化合物的添加回收率整體較好。但乙酸乙酯作為提取溶劑，其對包括脂肪在內(nèi)的非極性化合物有較高的選擇提取性，因此需要增加正己烷去脂的步驟，可以更好的去除磷脂等脂類共提取物，進(jìn)一步降低基質(zhì)干擾。同時(shí)加入正己烷后的復(fù)溶樣品應(yīng)避免劇烈振蕩，否則易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，造成目標(biāo)化合物的損失，影響回收率。

A.雞蛋；B.雞肉；C.豬肉

圖7 空白基質(zhì)樣品總離子流色譜

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)=基質(zhì)加標(biāo)溶液峰面積/溶劑加標(biāo)溶液峰面積，若比值大于1，說明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若小于1，則說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；若等于1，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)物定量準(zhǔn)確性的影響可通過內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行一定程度的校正，同時(shí)選擇基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線，有助于提高定量檢測的準(zhǔn)確性。

本文建立了雞蛋、雞肉和豬肉中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法，通過對色譜、質(zhì)譜條件和樣品前處理方法的優(yōu)化改進(jìn)，使該方法具有較高靈敏度，良好穩(wěn)定性，能滿足同時(shí)檢測畜禽產(chǎn)品中多種酰胺醇類藥物殘留的分析要求，可用于雞蛋、雞肉和豬肉中酰胺醇類藥物檢測，為制定相關(guān)檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)參考。