武曉英，劉地，曹貴東，李博，李娜，吳麗華，喬宏萍*

(1. 太原師范學院生物系，山西 晉中 030619；2. 山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，山西 太原 030032)

硒是動物正常生長和繁殖所必需的微量元素，在機體內(nèi)發(fā)揮著極其重要的生物學功能[1]。已有研究表明，硒是公畜精子生存和發(fā)育必需的微量元素[2]。動物缺乏硒，會影響公畜生殖器官的發(fā)育和生殖細胞的形成，導致繁殖機能障礙[3]。因此缺硒被認為是引起精子質(zhì)量下降的原因之一[4]。如添加適量的硒，可明顯改善精子活力和活動精子百分率，并降低精子畸形率，提高后代的繁殖性能[5]。而且研究發(fā)現(xiàn)，硒能通過調(diào)節(jié)細胞活性氧自由簇(ROS)的產(chǎn)生來調(diào)控細胞凋亡，硒的缺乏更容易導致ROS的產(chǎn)生，使組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應并引起細胞凋亡，補硒可以防止睪丸組織脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[2,6]。本試驗通過在哺乳期母羊日糧中添加納米硒，研究硒元素通過母乳向后代羔羊轉(zhuǎn)移的情況，以及對后代生殖系統(tǒng)睪丸發(fā)育的影響，為提高后代羔羊的繁殖性能提供可靠的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)試驗

1.1.1 試驗地點概況

試驗地點：山西省忻州地區(qū)西南部的岢嵐縣，為我國典型的缺硒地區(qū)(0.03～0.06 mg/kg)。

1.1.2 試驗動物、試驗設計與日糧配制

本試驗時間為120 d，選擇體重相近，產(chǎn)單胎公羔的母羊12只，從母羊產(chǎn)羔至羔羊斷奶期間，隨機分為2組，每組6只，一組母羊飼喂基礎日糧，為對照組(C組)；另一組在基礎日糧的基礎上添加0.5 mg/kg的Nano-Se(上海四通納米技術港有限公司)，為試驗組(S組)。母羊的基礎日糧參照NRC (2007) 哺乳期絨用山羊的飼養(yǎng)標準配制而成，組成見表1。分組的母羊分欄飼喂，定時定點放牧。

1.2 主要試劑與儀器

抗氧化力谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；TaKaRa TRIzol Reagent、TaKaRa RT Reagent Kit和TaKaRa SYBR PremixExTaqTM試劑盒購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

表1 基礎日糧配方與主要營養(yǎng)成分

日糧組成 含量/%營養(yǎng)成分2含量玉米 大豆秸稈 葵花餅 麩皮 食鹽 磷酸鈣 預混料1 苜蓿 玉米秸稈 大豆粉 18.0414.553.842.20.60.50.430.0025.274.59粗蛋白/% 消化能/(MJ·kg-1)鈣/%磷/%硒/(MJ·kg-1)酸性洗滌纖維/%中性洗滌纖維/%10.089.640.750.30.0432.0946.53

注：1每千克日糧中含量：FeSO4·7H2O 20 mg; MnSO4·H2O 18 mg; ZnSO4·7H2O 45 mg; CuSO4·5H2O 25 mg; CoCl2·6H2O 0.2 mg; KI 1.2 mg 維生素A 2 000 U(或600 μg); 維生素D 500 U(或12.5 μg); 維生素E 225 U(或150.3 mg)。2除消化能為計算值外，其他全部為實測值。

2100型可見光分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司UNIC)；CX43奧林巴斯顯微鏡(日本Olympus)；RM2235徠卡組織切片機(德國Leica)；SK-2003A原子熒光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo)；ABI QuantStudio熒光定量PCR擴增儀(美國ABI)。

1.3 樣品采集

母乳和血樣采集：羔羊出生后12 h內(nèi)采集母羊初乳，在羔羊斷奶之前，采集母羊與羔羊的血液，同時析出血清，分裝于1.5 mL離心管中，置-70 ℃保存待測。

組織樣的采集：在羔羊120 d斷奶后，迅速屠宰母羊取母羊的肝、腎、心等組織，并同時采集羔羊的肝、腎、心和睪丸組織樣，將從妊娠母羊及胎兒所取的組織樣本迅速投放入液氮中用于生化檢測。

1.4 硒含量測定

取血樣和組織樣用濃硫酸完全消化，加入雙氧水加熱至溶液清亮無色，定容后采用原子熒光光度計進行檢測。

1.5 抗氧化能力測定

羔羊睪丸組織中的GSH-Px活性采用DTNB法試劑盒檢測(批號：20180604)；SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法試劑盒檢測(批號：20180604)；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法試劑盒檢測(批號：20180604)。所有測定過程嚴格按照南京建成生物工程研究所試劑盒中的操作指南進行。

1.6 睪丸組織TUNEL檢測和精子形態(tài)學觀察

制備睪丸組織的石蠟包埋切片，利用TUNEL試劑盒(批號：20180626)中的地高辛標記凋亡細胞DNA的3′ -OH末端，再結(jié)合鏈酶親和素-過氧化物酶(SABC)，最后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，并于顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。每個個體在顯微鏡下取至少5個視野進行拍照，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，得出每個視野中的陽性細胞數(shù)。

收集附睪中的精液，經(jīng)離心獲取精子，稀釋至適當濃度后采用巴氏染色法進行染色觀察，每個樣品連續(xù)計數(shù)200個精子。

1.7 睪丸組織凋亡基因檢測

1.7.1 總RNA提取和cDNA合成

按照TaKaRa TRIzol Reagent試劑盒(批號：20180612)操作說明，分別提取每組6只120日齡羔羊睪丸組織的總RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解，紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度，調(diào)整濃度至1 μg/μL左右，-80 ℃保存。

按照TaKaRa RT Reagent Kit試劑盒(批號：20180615)操作說明，用隨機引物對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA于-20 ℃保存。

1.7.2 引物設計及合成

利用Primer 5.0的引物設計軟件，根據(jù)Genebank登錄的B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、促凋亡基因(Bax)和 GAPDH的cDNA序列，設計表2的上下游引物，引物由上海生工生物工程公司合成。

表2 實時熒光定量所用引物序列

基因引物(5' →3' )基因序列號引物長度/bpBcl-2F: GATGACCGAGTATCTGAACCG R: GACAGCCAGGAGAAATCAAACANM_001166486120BaxF: TCGGTCTCAACGGCTACA R: CCACTCCAGCCACAAAGANM_173894189GAPDHF: GGTGATGCTGGTGCTGAGR: TGACAATCTTGAGGGTGTTGNM_173894181

1.7.3 定量標準曲線的繪制和Real-time PCR

不同組織總RNA提取純化后，測定濃度，并將其稀釋到1 μg/μL,作為標準曲線中濃度最高的模板，然后將其依次10×稀釋7個梯度，控制所有要檢測的mRNA濃度在此梯度稀釋濃度范圍內(nèi)，用于標準曲線的制作。

根據(jù)TaKaRa SYBR PremixExTaqTM試劑盒(批號：20180615)建議反應條件構(gòu)建二步PCR循環(huán)反應體系，選用GAPDH基因做為內(nèi)參，每個樣本重復3次，根據(jù)標準曲線以及熒光曲線Ct值計算定量結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并進行F檢驗和Duncan多重比較。試驗組與對照組之間的差異顯著用字母表示，大寫字母不同代表差異極其顯著(P<0.01)，小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 母源納米硒對母乳、母羊和羔羊血液中硒含量的影響

表3結(jié)果顯示，哺乳母羊日糧中納米硒的添加極顯著提高了S組母羊初乳和常乳中硒的含量(P<0.01)，同時極顯著提高了母羊與羔羊血液中硒的含量(P<0.01)。同一組別血液與母乳硒含量比較顯示，C組母羊血液中硒含量顯著高于初乳(P<0.05)，且母羊血硒>初乳>羔羊血硒>常乳。S組母羊初乳中硒的含量極顯著高于母羊和羔羊血液、母羊常乳中硒的含量(P<0.01)，S組中硒含量高低比較為初乳>母羊血硒>羔羊血硒>常乳。

2.2 母源納米硒對母羊和羔羊不同組織中硒含量的影響

由表4可知，哺乳母羊日糧中加入納米硒，母羊和羔羊組織中硒的含量S組都極顯著高于C組(P<0.01)；比較同一組別母羊與羔羊相同組織中硒的含量，母羊組織硒含量顯著高于羔羊(P<0.05)；C組與S組母羊組織中硒的沉積順序是腎臟>肝臟>心肌，C組羔羊組織中硒的沉積順序是腎臟>肝臟≈睪丸>心肌，S組羔羊組織中硒的沉積順序是睪丸>腎臟>肝臟>心肌。

表3 母源納米硒對母乳、血硒含量的影響(n=6) μg·mL-1

組別母乳硒含量血液硒含量初乳常乳母羊羔羊C0.12±0.02B0.04±0.01B**0.15±0.02B*0.08±0.01B* S0.92±0.03A0.34±0.07A**0.76±0.03A**0.57±0.02A**

注：同列數(shù)據(jù)肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。同行數(shù)據(jù)和初乳比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

表4 母源納米硒對母羊與羔羊組織硒含量的影響(n=6) μg·g-1

組織羔羊母羊C組S組C組S組肝0.20±0.02B0.42±0.03A0.24±0.01B*0.48±0.04A*腎0.25±0.01B0.51±0.04A0.31±0.01B*0.65±0.03A*心0.17±0.01B0.32±0.01A0.22±0.03B*0.35±0.02A*睪丸0.21±0.04B0.76±0.04A

注：同行數(shù)據(jù)組間比較，肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。同行羔羊與母羊組內(nèi)比較，肩標*表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 母源納米硒對羔羊睪丸組織抗氧化性能的影響

由表5可知，哺乳母羊日糧中加入納米硒，S組羔羊睪丸組織中SOD的活性顯著提高(P<0.05)，GSH-Px的活性極顯著提高(P<0.01)，MDA的濃度極顯著降低(P<0.01)。

表5 母源納米硒對羔羊睪丸組織抗氧化性能的影響

組別SOD/(U·mg-1)GSH-Px/(U·mg-1)MDA/(nmol·mg-1)C51.24±8.02b98.41±5.01B7.31±0.21AS83.25±10.03a164.58±11.07A2.18±0.42B

注：同列數(shù)據(jù)組間比較，大寫字母不同表示差異極其顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.4 母源納米硒對羔羊睪丸組織發(fā)育的影響

表6結(jié)果顯示，哺乳母羊日糧中添加納米硒，羔羊睪丸組織的重量極顯著增加(P<0.01)，睪丸長度和睪丸周徑顯著增長(P<0.05)。

表6 母源納米硒對羔羊睪丸組織發(fā)育的影響(n=6)

組別睪丸重量/g睪丸長度/cm睪丸周徑/cmC43.23±3.54B7.02±1.02b9.34±0.88bS65.12±6.23A8.97±0.97a12.18±1.03a

2.5 母源納米硒對睪丸組織細胞凋亡和精子形態(tài)的影響

圖1結(jié)果顯示，哺乳期母羊日糧中添加納米硒，硒通過母乳向羔羊傳遞，S組羔羊睪丸組織細胞凋亡數(shù)量極顯著降低(P<0.01)。

由表7結(jié)果可知，C組和S組羔羊精子中都沒有完全缺陷型精子，缺硒C組羔羊精子畸形率極顯著高于補硒的S組(P<0.01)。

Sz.精子；Sg.精原細胞；PS.初級精母細胞；IC.睪丸間質(zhì)細胞

組間大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖1 母源納米硒對羔羊睪丸組織細胞凋亡的影響

表7 母源納米硒對羔羊精子形態(tài)的影響(n=6)

組別正常頭部缺陷頸部和中段缺陷尾部缺陷完全缺陷總數(shù)精子畸形率/%C67.52±3.52A32.21±2.76A64.47±5.63A35.62±3.41A020066.31±3.24AS149.14±9.78B10.16±1.21B32.54±3.22B8.43±1.34B020032.16±1.57B

2.6 母源納米硒對睪丸組織凋亡基因表達的影響

圖2 母源硒對睪丸組織中Bax和Bcl-1基因表達的影響

3 討論

3.1 母源硒對母羊血乳屏障硒傳遞的影響

營養(yǎng)物質(zhì)可以通過胎盤和母乳由母體向后代進行轉(zhuǎn)移[7]。妊娠期胎盤作為母體和胎兒之間物質(zhì)轉(zhuǎn)運紐帶，使硒在胎盤轉(zhuǎn)運過程中優(yōu)先供給胎兒，導致胎兒血液中硒的含量明顯高于母體[8]；而在哺乳期，乳汁又成為轉(zhuǎn)移營養(yǎng)物質(zhì)的主要載體，動物血液、組織和乳汁中的硒含量會受到日糧中硒含量的影響，研究發(fā)現(xiàn)妊娠母牛血液中硒的含量與其所產(chǎn)小牛的硒含量存在正相關[9]。本試驗納米硒組母羊初乳和常乳以及母羊和羔羊血液中硒含量提高與前人結(jié)果一致，說明硒可以通過血乳屏障進行轉(zhuǎn)運。但同時試驗結(jié)果顯示硒的轉(zhuǎn)運具有選擇性，在缺硒的C組，母羊血硒含量高于初乳中硒的含量，考慮哺乳母羊優(yōu)先滿足自身對硒的需求；補硒的S組，母羊初乳中硒的含量高于母羊血硒含量。初乳是提高后代免疫力的重要因素，鮮有人報道初乳中硒的含量與血乳屏障的選擇性轉(zhuǎn)運有關[7]。本試驗證實，在哺乳期母羊日糧中補充適量納米硒可以促進硒優(yōu)先轉(zhuǎn)運進入初乳中。本試驗目的是研究硒對后代生殖發(fā)育的影響，因此初乳中硒含量增高對后代機體免疫力的影響還有待進一步研究證實。

3.2 母源硒對組織硒沉積和羔羊睪丸組織發(fā)育的影響

硒元素是生物機體必需的微量元素，嚴重缺硒可以引起畜禽的大規(guī)模死亡[10]。硒可以沉積在不同的組織器官中，但在含量分布上有一定差異，已有報道，雄性動物睪丸組織中硒的含量較高[11]。郭云霞等[12]在柴雞飼喂酵母硒的研究中發(fā)現(xiàn)，組織中硒的沉積順序是腎臟>肝臟>肌肉。在本試驗中，C組與S組母羊組織中硒的沉積順序均與此一致；而羔羊硒的沉積在2組中不一致，睪丸組織在C組中并沒有表現(xiàn)出明顯的沉積優(yōu)勢，考慮當?shù)仉m處于缺硒地帶，缺硒尚未引起畜禽的大規(guī)模死亡，但繁殖力較低，這可能與與雄性動物睪丸組織缺硒有關。已有許多研究表明，雄性動物睪丸的發(fā)育與硒緊密相關，硒對雄性生殖器官的發(fā)育和精子活力都有顯著影響[4,13]。當動物缺硒時，睪丸和附睪的重量減輕[14]。我們的研究結(jié)果同樣顯示哺乳母羊日糧缺硒會直接影響后代羔羊睪丸組織的發(fā)育和精子的形態(tài)。

3.3 母源硒對羔羊睪丸組織抗氧化性能及細胞凋亡的影響

硒是體內(nèi)許多酶的活性中心組成成分[1]，可清除ROS[2,6]，減少脂質(zhì)過氧化物(LPO)的產(chǎn)生[15]，保護臟器及組織免遭氧化損傷[16]。硒是GSH-Px的活性中心組成成分，組織中GSH-Px能保護細胞膜的結(jié)構(gòu)免受過氧化損傷，減少脂質(zhì)過氧化物MDA在體內(nèi)的積蓄。SOD也能夠清除體內(nèi)的自由基并阻斷LPO的鏈式反應。該試驗中cGPX、SOD和MDA的含量變化，表明哺乳母羊日糧中納米硒的添加提高了羔羊睪丸組織的抗氧化力，降低了脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。

細胞在體內(nèi)酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的作用下維持體內(nèi)氧化平衡，一旦平衡被破壞，細胞內(nèi)的核酸會遭受氧化損傷[17]。研究發(fā)現(xiàn)，硒能通過調(diào)節(jié)細胞的DNA損傷和ROS的產(chǎn)生調(diào)控細胞凋亡[18]。本試驗中哺乳母羊日糧中缺硒導致后代羔羊睪丸組織中精原細胞、初級精母細胞和間質(zhì)細胞的凋亡，而S組中僅精原細胞發(fā)生凋亡，提示睪丸組織的凋亡首先從精原細胞開始。

目前，Bcl-2基因家族是研究比較多的凋亡相關基因[19]。其中Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，Bax是促凋亡基因。本試驗中C組Bax表達的升高，與TUNEL法檢測睪丸組織細胞凋亡結(jié)果一致。

綜上所述，母源硒通過母乳傳遞給后代公羔，不但提高了羔羊血液和組織中硒的含量和抗氧化力，而且睪丸組織有明顯的硒沉積優(yōu)勢。硒的添加降低了后代睪丸組織細胞凋亡，促進睪丸組織發(fā)育，降低了精子畸形率。