張雄，史開志*，陳大軍，張勇，楊紅，王天松

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005；2. 赫章九龍農(nóng)業(yè)旅游開發(fā)有限公司，貴州 赫章 553200；3. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；4. 畢節(jié)市畜禽遺傳資源管理站，貴州 畢節(jié) 551700)

沉默信息調(diào)節(jié)因子(sirtuins)是一類動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理的進(jìn)化保守酶。哺乳動(dòng)物有7種SIRT(SIRT 1～7)，它們位于不同的細(xì)胞間且具有不同的功能[1-3]。SIRT5屬于一種位于多個(gè)亞細(xì)胞位點(diǎn)的Sirtuin異構(gòu)體，具有多種酶活性，包括依賴NAD的組蛋白去乙?；?、賴氨酸脫鈣酶等，這些酶活性表明SIRT5在糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸氧化等多種細(xì)胞代謝過(guò)程中起著重要作用[4-6]。

王利紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)SIRT5基因在蘇姜豬各組織中廣泛表達(dá)，且在胃、腸等物質(zhì)能量代謝旺盛的組織表達(dá)量較高。Rardin等[8]指出SIRT5在小鼠近端腎小管上皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)線粒體與過(guò)氧化物酶體脂肪酸氧化的平衡。桂林生[9]對(duì)秦川牛SIRT5基因進(jìn)行SNP檢測(cè)，在第7內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，其中G22010A 和G22052A位點(diǎn)基因型與秦川牛背膘厚和眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)，優(yōu)勢(shì)基因型分別為GG和GA。

鑒于SIRT5基因在動(dòng)物脂質(zhì)代謝途徑中調(diào)節(jié)作用，且在國(guó)內(nèi)地方豬分子多態(tài)性研究中鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以4個(gè)豬資源群體作為為試驗(yàn)對(duì)象，利用DNA混池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，系統(tǒng)分析SIRT5基因外顯子區(qū)域多態(tài)位點(diǎn)，為今后挖掘與性狀表型值關(guān)聯(lián)的特征標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集

從江香豬育肥豬66份血樣采自貴陽(yáng)市綠生源香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場(chǎng)；黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬60份血樣采自貴州自然之園生態(tài)農(nóng)業(yè)高坡養(yǎng)殖基地；夜郎黃金豬(可樂(lè)豬♀×野豬♂)34份血樣采自赫章九龍農(nóng)業(yè)旅游有限公司養(yǎng)殖基地；大約克豬47份血樣采自貴陽(yáng)市臺(tái)農(nóng)種豬養(yǎng)殖基地。以上豬血樣均采用上海生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(血液)提取其基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

瓊脂糖、2×TaqMaster Mixture、核酸染料、DL 2000-Marker均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考豬SIRT5基因全序列(登錄號(hào):NC_010449.5)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)SIRT5基因外顯子區(qū)擴(kuò)增引物，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物詳見表1。

表1 引物序列信息

引物名稱引物序列(5'→3')退火溫度/℃片段長(zhǎng)度/bp擴(kuò)增區(qū)域SIRT5-1F:CTAGGAGCGCCTGAGAACACR:CAGAGTGGCTTTCTCCAAGG60436外顯子1SIRT5-2F:GAGGTGCGTGGCGAGGTTTR:ATCCAGCGTTGCCGTGAGC59472外顯子2SIRT5-3F:GATTTTCCAGGGTCCCTCATR:CACTCCAGGATCGTGTTAAGC58505外顯子3SIRT5-4F:AGTCCCTGGTCGCGTAGTAAR:TCCTGTGGTTTGCACTGAAC58522外顯子4SIRT5-5F:CTCTGGAGGGAGAACCACTGR:CCTGTCACCCCAGGCTAATA58636外顯子5SIRT5-6F:GGCACCTAAAAGCAGGACAAR:AGGGGAAAGGCTTTGAGAAG58560外顯子6SIRT5-7F:GCACAACCAGAATGTGAACGR:CGTTTGCTTCCATCAGAACA57554外顯子7SIRT5-8F:ATCATCTGTGTGGTGCCTGAR:ACACCTTTACTCCCCCTGCT60656外顯子8

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL(20 ng/μL)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選特異性好的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 變異位點(diǎn)篩選及等位基因頻率估算

豬SIRT5基因原序列與測(cè)序峰圖運(yùn)用Megalign和Seqman軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定SNPs位點(diǎn)。使用MWsnap 3.0軟件測(cè)量各SNPs等位基因的相應(yīng)高度，等位基因頻率計(jì)算公式如下：Fi=Hi/(H1+H2)(i=1，2)。式中：Fi表示 SNP位點(diǎn)等位基因頻率，H1、H2表示等位基因在測(cè)序峰圖上的高度。

1.6 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用在線生物信息學(xué)分析軟件RNAfold WebServer對(duì)豬SIRT5基因突變前后的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)SIRT5基因第1～8外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。由圖可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致，特異性良好，達(dá)到測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)。

A.第1外顯子；B. 第2外顯子；C. 第3外顯子；D. 第4外顯子；E. 第5外顯子；F. 第6外顯子；G. 第7外顯子；H. 第8外顯子

M.DL2000 Marker；1.從江香豬；2.黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬；3.夜郎黃金豬；4.大約克豬

圖1 豬SIRT5基因外顯子區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

2.2 序列比對(duì)與SNP位點(diǎn)挖掘

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用DNAStar軟件中Seqman程序?qū)y(cè)序結(jié)果與NCBI中公布杜洛克豬SIRT5基因進(jìn)行序列比對(duì)，在豬SIRT5基因外顯子區(qū)挖掘得到3個(gè)SNPs位點(diǎn)(見圖2)。參照豬SIRT5基因mRNA完整序列，以第1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+1，分別將3個(gè)變異位點(diǎn)命名為：G515A、C831T和A882G。其中，G515A位于第4外顯子區(qū)，為錯(cuò)義突變位點(diǎn)，可導(dǎo)致第170位氨基酸發(fā)生改變，由甘氨酸改變?yōu)楣劝彼?；C831T和A882G位點(diǎn)分別位于第7和第8外顯子區(qū)，均為同義突變位點(diǎn)。

2.3 等位基因頻率估算

通過(guò)MWsnap 3.0軟件標(biāo)尺對(duì)4個(gè)豬群體的3個(gè)SNPs位點(diǎn)峰高進(jìn)行測(cè)量，并根據(jù)等位基因頻率計(jì)算公式進(jìn)行頻率估算，結(jié)果見表2。從表中可見，G515A位點(diǎn)中，僅在黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬出現(xiàn)較高的多態(tài)性，G和A預(yù)測(cè)等位基因頻率值相近，而在從江香豬、夜郎黃金豬和大約克豬種中均呈現(xiàn)出單峰，為偏態(tài)分布；C831T位點(diǎn)中，從江香豬和夜郎黃金豬中以C預(yù)測(cè)等位基因頻率值較高，且在從江香豬群體中C和T頻率值相近，多態(tài)含量豐富，在大約克豬和黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬以T預(yù)測(cè)等位基因頻率值高；A882G位點(diǎn)中預(yù)測(cè)頻率值分布呈現(xiàn)出從江香豬多態(tài)豐富，大約克豬偏態(tài)分布。

1.從江香豬；2.黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬；3.夜郎黃金豬；4.大約克豬

圖2 不同品種豬SIRT5基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)測(cè)序比對(duì)峰圖

表2 等位基因頻率估算結(jié)果

SNPs所處位置從江香豬黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬夜郎黃金豬大約克豬G515A第4外顯子G(1)G(0.49)G(1)G(1)A(0)A(0.51)A(0)A(0)C831T第7外顯子C(0.56)C(0.19)C(0.77)C(0)T(0.44)T(0.81)T(0.23)T(1)A882G第8外顯子A(0.53)A(0.22)A(0.62)A(0)G(0.47)G(0.78)G(0.38)G(1)

2.4 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

豬SIRT5基因突變前后mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C831T和A882G位點(diǎn)突變前后均不導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而G515A位點(diǎn)突變后，豬SIRT5基因mRNA最小自由能由-358.2 kcal/mol變?yōu)?359.0 kcal/mol，突變后，自由能值每摩爾降低了0.8 kcal，RNA穩(wěn)定性提高。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)直接測(cè)序法在4個(gè)豬資源群體中共篩選到SIRT5基因的3個(gè)變異位點(diǎn)，分別為G515A、C831T和A882G，其中G515A屬于錯(cuò)義突變，可導(dǎo)致甘氨酸(脂肪族類)改變?yōu)楣劝彼?酸性氨基酸類)。毛圓輝[10]分析基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在翻譯過(guò)程中的功能，發(fā)現(xiàn)mRNA可通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程，形式較為復(fù)雜，但最終表現(xiàn)為對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著正相關(guān)調(diào)控，且這種正相關(guān)不受mRNA結(jié)構(gòu)、豐度等其它因素的影響。本研究中，G515A位點(diǎn)可降低豬SIRT5基因mRNA最小自由能值，提升mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，鑒于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)表達(dá)量正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步推測(cè)G515A位點(diǎn)突變后，可大幅提高SIRT5蛋白表達(dá)水平，加快豬體內(nèi)脂質(zhì)代謝進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)皮下脂肪快速沉積。同時(shí)，該變異位點(diǎn)僅在黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬群體中出現(xiàn)高頻率的多態(tài)分布，而在從江香豬、夜郎黃金豬和大約克豬群體中均無(wú)多態(tài)性分布，推測(cè)豬SIRT5基因G515A位點(diǎn)具有極高偏向性與品種相關(guān)性，或許僅在巴克夏或貴州黔北黑豬群體中存在突變，可將其作為豬特有的分子標(biāo)簽加以開發(fā)利用。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，C831T和A882G 2個(gè)SNPs位點(diǎn)在從江香豬資源群體中多態(tài)信息含量豐富，變異豐度高，而在大約克豬中呈現(xiàn)偏態(tài)分布。出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是由于豬種的不同、生存地理環(huán)境的差異，導(dǎo)致基因在配子中的隨機(jī)分離和在合子里的隨機(jī)重組出現(xiàn)一定偏差，引起基因頻率的變化，最終導(dǎo)致等位基因頻率差異化，形成不同的表型性狀[11]。同時(shí)，根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)的從江香豬群體中C831T和A882G位點(diǎn)變異程度大、多態(tài)含量豐富的特點(diǎn)，便于群體中有利基因型的定向選擇，其在今后的分子選育工作中獲得更大遺傳進(jìn)展及作為育種標(biāo)記的潛力更大[12]。鄧冠群[13]在秦川牛SIRT5基因3′UTR處挖掘出4個(gè)SNP，且突變位點(diǎn)的不同基因型對(duì)部分體尺和肌間脂肪指標(biāo)影響顯著。Shuai等[14]研究闡述了SIRT5對(duì)皮膚下白色脂肪組織中的棕色脂肪細(xì)胞分化具有調(diào)節(jié)作用，且是棕色脂肪基因體外激活所必須的。結(jié)合SIRT5基因定位以及在脂質(zhì)代謝中的重要功能，后期課題組將開展豬SIRT5基因SNPs位點(diǎn)與胴體肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證G515A、C831T和A882G位點(diǎn)與地方豬背膘厚及瘦肉率指標(biāo)間的相關(guān)性，發(fā)掘出可調(diào)節(jié)地方豬脂肪沉積的關(guān)鍵變異位點(diǎn)。