彭艷, 孫鑫, 周培富, 楊成, 曾廣能, 范百齡

貴州兩處茶園溶磷青霉菌的篩選、鑒定及溶磷能力分析

彭艷1,*, 孫鑫1, 周培富2, 楊成1, 曾廣能1, 范百齡1

1. 貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院, 貴州 550025 2. 貴州民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院, 貴州 550025

為維持土壤自然完整性、活化利用土壤中難溶性磷, 從貴州名茶產(chǎn)地都勻、貴定茶園土壤中篩選高效溶磷真菌, 為制備真菌肥料提供菌種資源。利用溶磷指數(shù)(SPI)、形態(tài)特征和ITS rDNA序列篩選、鑒定菌株, 并采用液體搖床培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定鑒定菌株在以磷酸鈣、磷酸鐵或磷酸鋁為唯一磷源的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中的溶磷能力。共篩選到7個(gè)高效溶磷菌落, 經(jīng)形態(tài)觀察分屬2種菌株, 鑒定為微紫青霉()和赭綠青霉()。液體培養(yǎng)基接種、搖床培養(yǎng)15 d, 微紫青霉菌在以Ca3(PO4)2、Fe3(PO4)2或AlPO4為唯一磷源的上清液中有效磷含量分別為73.47 mg·L–1、30.93 mg·L–1和14.00 mg·L–1, 4℃繼續(xù)保存至30d后對(duì)Fe-P和Al-P的溶解量分別達(dá)到72.20 mg·L–1、32.84 mg·L–1; 赭綠青霉菌培養(yǎng)15d的溶磷量分別為30.72 mg·L–1、4.14 mg·L–1和1.51 mg·L–1, 30d對(duì)Fe-P和Al-P的溶解量分別達(dá)到35.19 mg·L–1和10.98 mg·L–1。微紫青霉菌溶解無機(jī)磷能力明顯優(yōu)于赭綠青霉菌, 有望應(yīng)用于地區(qū)缺磷茶園土壤真菌肥料的制備。

茶園; 溶磷真菌; 溶磷能力; 微紫青霉; 赭綠青霉

0 引言

磷(P)元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必須營(yíng)養(yǎng)元素, 參與植物體內(nèi)的糖類代謝、含氮化合物代謝、碳水化合物運(yùn)輸?shù)壬磉^程, 并能調(diào)節(jié)植物光合作用。據(jù)報(bào)道, 我國(guó)約74%耕地土壤缺磷, 磷肥在土壤中當(dāng)季利用率一般只有10%—25%[1-2], 缺磷會(huì)導(dǎo)致植物糖分運(yùn)輸、蛋白質(zhì)合成受阻, 生長(zhǎng)緩慢, 植株矮小, 新生長(zhǎng)的葉片小而薄, 產(chǎn)量降低。實(shí)際上許多土壤的全磷含量相當(dāng)高, 但植物可吸收的有效磷很低[3], 尤其是熱帶、亞熱帶高溫多雨地區(qū), 養(yǎng)分大量淋失, 土壤中鐵、鋁等對(duì)磷強(qiáng)烈固定, 土壤缺磷已成為作物生長(zhǎng)的主要限制因素[4]。傳統(tǒng)的改土施肥法并不能有效解決土壤缺磷問題, 且長(zhǎng)期過量施用化肥、高復(fù)種指數(shù)和連作等會(huì)導(dǎo)致土壤地力和肥料利用率下降, 土壤質(zhì)量健康、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題日益嚴(yán)重。因此, 挖掘與利用土壤中難溶性磷來解決土壤缺磷問題, 一直是相關(guān)研究工作者普遍關(guān)注的問題。2017年聯(lián)合國(guó)世界土壤日主題活動(dòng)讓“親土種植”理念備受關(guān)注, 該理念倡導(dǎo)“種植與環(huán)保并舉”, 涵蓋“改良土壤, 減肥增效、品質(zhì)提升, 綜合管理”等要求, 這對(duì)活化土壤中難溶性磷、提高磷肥效率和產(chǎn)品品質(zhì)、環(huán)境友好等方面的要求越發(fā)突出。

近年來, 歐美等發(fā)達(dá)經(jīng)濟(jì)體系紛紛聚焦生物經(jīng)濟(jì), 認(rèn)為其是增進(jìn)經(jīng)濟(jì)、科研全球競(jìng)爭(zhēng)力、實(shí)現(xiàn)智慧發(fā)展和綠色發(fā)展的關(guān)鍵要素; 我國(guó)也相繼出臺(tái)相關(guān)政策, 中共中央、國(guó)務(wù)院《關(guān)于加大改革創(chuàng)新力度加快農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化建設(shè)的若干意見》明確要“大力推廣生物有機(jī)肥”, 國(guó)家發(fā)展改革委《“十三五”生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》提出要“突破微生物和生物功能物質(zhì)篩選與評(píng)價(jià)……等關(guān)鍵技術(shù), 創(chuàng)制和推廣一批高效固氮溶磷、促生增效、新型復(fù)合及專用等綠色高效生物肥料新產(chǎn)品”。生物肥料是指一類含有大量活的微生物的特殊肥料, 施入土壤后通過微生物生命代謝活動(dòng)來提供作物需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或產(chǎn)生激素來刺激作物生長(zhǎng), 改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì), 目前推廣應(yīng)用的主要有根瘤菌類肥料、固氮菌類肥料、溶磷解鉀菌類肥料、抗生菌類肥料和真菌類肥料等。土壤溶磷微生物(也稱解磷微生物)可通過釋放質(zhì)子、分泌有機(jī)酸和磷酸酶等代謝產(chǎn)物, 或是將植酸磷等同化為自身生物量、與其他生物競(jìng)爭(zhēng)磷等方式[5-8]來活化土壤中難溶的有機(jī)或無機(jī)磷酸鹽, 與植物對(duì)磷營(yíng)養(yǎng)的吸收關(guān)系密切[9], 對(duì)提高磷肥利用率有重要作用[10], 且其接種低磷土壤后的作物增產(chǎn)幅度大于接種高磷土壤[11-12]。土壤中溶磷真菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于溶磷細(xì)菌, 但普遍認(rèn)為真菌的溶磷量是細(xì)菌的幾倍甚至上百倍, 且其遺傳性狀穩(wěn)定[13], 傳代培養(yǎng)后一般不易失去溶磷能力。

茶是貴州省第三大經(jīng)濟(jì)作物, 也是貴州農(nóng)村經(jīng)濟(jì)重要組成部分。2018年貴州省茶園面積達(dá)752萬畝, 居全國(guó)第一位, 年總產(chǎn)值394億元, 帶動(dòng)貧困人口45.2萬元, 脫貧人數(shù)13.7萬人; 其中涉茶貧困戶人均年收入4381.2元, 較非涉茶貧困戶人均年收入高2109元。 “十四五”時(shí)期, 隨著“一帶一路”戰(zhàn)略的繼續(xù)實(shí)施和貴州交通建設(shè)的大發(fā)展, 貴州茶產(chǎn)業(yè)將迸發(fā)出巨大的需求。然而, 貴州茶園缺磷現(xiàn)象嚴(yán)重[14-16], 40%以上處于速效磷缺乏(3—5 mg·kg-1)、很缺乏(<3 m·kg-1)水平[17], 在茶園管理上茶農(nóng)通常采用垅間秸稈覆蓋、施草木灰、堆積茶樹修剪枝、施農(nóng)家肥等方式來增加土壤有機(jī)質(zhì)含量, 部分茶場(chǎng)配施有機(jī)肥和無機(jī)肥(如硝酸鉀、氮鉀寶、尿素等), 總體上較少施磷肥。在缺磷土壤上只施氮鉀肥不但會(huì)因養(yǎng)分失調(diào)而危害作物正常生長(zhǎng), 還會(huì)加劇氮肥損失率[18], 致使茶園生產(chǎn)投入成本增大, 并產(chǎn)生水體富營(yíng)養(yǎng)化、N2O等溫室氣體排放等環(huán)境問題。前人研究發(fā)現(xiàn), 各種茶樹對(duì)磷反應(yīng)都非常敏感, 磷的生物學(xué)效應(yīng)和增產(chǎn)提質(zhì)效果明顯[19], 土壤速效磷、無機(jī)磷中的含磷酸鹽(Al-P)與茶葉中的茶多酚、水浸出物含量顯著正相關(guān)[20], 缺磷使得葉片中茶多酚、游離氨基酸、黃酮類化合物、水浸出物總量和酚氨比降低[3], 影響茶湯品質(zhì)和口感。為維持土壤自然完整性、開發(fā)本土微生物資源、增加缺磷茶園土壤磷素營(yíng)養(yǎng)、提高農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入, 本研究從土壤磷素含量較適宜的2個(gè)名茶產(chǎn)區(qū)(都勻市, 盛產(chǎn)都勻毛尖茶; 貴定縣, 盛產(chǎn)貴定云霧茶)篩選土壤溶磷真菌, 觀察菌株菌絲和孢子形態(tài)、分生孢子結(jié)構(gòu)等, 并對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定, 分析其溶磷能力, 為制備適用于地區(qū)缺磷茶園的真菌肥料提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于貴州省黔南州都勻市和貴定縣, 其中都勻地處107°7′—107°46′ E, 25°51′—26°26′ N之間, 西與貴定縣相鄰, 貴定縣地處107°08′—107°15′ E, 26°40′—26°47′ N之間, 同屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候, 無霜期長(zhǎng)、雨量豐沛, 多云霧照、陰雨天, 茶園面積均在20萬畝左右, 土壤類型以黃壤為主。

1.2 樣品采集

以土壤類型、茶樹種類、海拔高度、氣候條件為指標(biāo), 選擇萬畝以上規(guī)模的茶場(chǎng), 2018年5月順著省道和縣道在遠(yuǎn)離林緣且生境因子基本一致的茶園沿途采集土壤樣品, 每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)樣方, 每個(gè)樣方5 m×10 m, 刮去枯枝落葉和浮土后按S形法采集樣方內(nèi)0—20 cm的表層土壤, 揀出樹根、石頭等, 分別混合成一個(gè)土壤樣品, 裝入鐵絲無菌采樣袋后帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃保存。采樣點(diǎn)茶樹種均為福鼎大白茶(. cv.), 土壤類型為黃壤, 其中都勻市采集茶園土壤4份、貴定縣采集5份(表1)。

1.3 供試材料

1.3.1 培養(yǎng)基

無機(jī)磷培養(yǎng)基: 葡萄糖10 g, (NH4)2SO40.5 g, 酵母浸出粉0.5 g, NaCl 0.3g, KCl 0.3 g, MgSO40.3 g, FeSO4·7H2O 0.03 g, MnSO4·H2O 0.03 g, Ca3(PO4)25.0 g, 瓊脂15 g, 蒸餾水1000 mL, pH 7.0—7.5。

PDA培養(yǎng)基: 馬鈴薯浸粉5 g, 葡萄糖20 g, 瓊脂15 g, 氯霉素0.1 mL, 蒸餾水1000 mL, pH 5.8—6.26。

無機(jī)磷液體培養(yǎng)基: Ca-P液體培養(yǎng)基是在無機(jī)磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去掉瓊脂; Fe-P和Al-P液體培養(yǎng)基分別將Ca3(PO4)25.0 g 替換為Fe3(PO4)25.0 g、AlPO45.0 g, 再去掉瓊脂。

1.4 分析測(cè)定

1.4.1 理化測(cè)定和形態(tài)觀察

在pH酸度計(jì)上測(cè)定土壤pH值, 水土比為2.5:1; 采用鉬銻抗比色法[21]測(cè)定菌株溶磷能力; 利用光學(xué)顯微鏡(ICC50 HD)拍攝菌株菌絲和孢子形態(tài)及孢子結(jié)構(gòu)圖片。

1.4.2 溶磷真菌的初篩

無菌條件下稱取10 g于4 ℃冰箱保存的新鮮土壤樣品, 加入裝有90 mL 0.85%滅菌的生理鹽水的錐形瓶中, 于28℃數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱中振蕩30 min, 轉(zhuǎn)速280 r·min-1, 使土樣與水完全混合。用0.85%滅菌水將土壤樣品稀釋至10–2—10–5倍, 分別用吸取0.1 mL土壤懸浮液涂布于無機(jī)磷培養(yǎng)基平板上, 每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)平板。倒置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d, 4 ℃保存3 d后, 挑取平板上具有溶磷圈且長(zhǎng)勢(shì)良好的真菌菌落, 迭代培養(yǎng)4次以增強(qiáng)其溶磷能力至出現(xiàn)明顯溶磷圈, 測(cè)定菌落直徑()和溶磷圈直徑(), 計(jì)算溶磷指數(shù)(),=(+)/。選取值在2.1—2.5之間的真菌菌落, 轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基斜面4 ℃保存。

注：*為固體聚磷酸銨肥田間肥效滴灌(水肥一體化)試驗(yàn)基地，1為空白對(duì)照CK(水肥一體化推薦施肥量),2為水肥一體化推薦施肥量+0.5% DMPP ( 3,4-二甲基吡唑磷酸鹽); 2.同一列不同大或小寫字母表示組間在0.05水平上差異顯著。

1.4.3 菌株復(fù)篩

在PDA培養(yǎng)基上選取6個(gè)6 mm直徑的菌塊, 分別接入以磷酸鈣(5 mg·L–1)、磷酸鋁(5 mg·L–1)、磷酸鐵(5 mg·L–1)為唯一磷源的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中。以接入無菌水作為對(duì)照, 每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種后于28 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)15 d, 4 ℃冰箱保存至30 d, 定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液pH值。發(fā)酵液用超聲波破碎并10000 r·min-1離心各10 min, 取上清液采用鉬銻抗比色法在波長(zhǎng)700 nm下測(cè)定可溶性磷含量。

1.4.4 溶磷真菌DNA的提取和鑒定

用土壤基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA, 采用真菌鑒定通用引物ITS1(5'-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3')、ITS4(5'- TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3')在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)體系為: T5 Mix 25 μL, PF(10P) 1 μL, PR(10P) 1 μL, gDNA 1 μL, dH2O 20 μL, 引物各1 μL; 擴(kuò)增條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min, 98 ℃變性10 s, 55 ℃退火15 s, 72 ℃延伸10 s, 30個(gè)循環(huán), 然后72 ℃終延伸5 min, 4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳, 150 V、100 mA、20 min電泳觀察ITS擴(kuò)增效果并拍照。PCR 產(chǎn)物電泳條帶切割所需 DNA 目的條帶, 純化PCR產(chǎn)物用送成都擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010計(jì)算處理, 用Sigmaplot 13.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩

選取無機(jī)磷培養(yǎng)基平板上具有明顯溶磷圈且長(zhǎng)勢(shì)良好的7個(gè)真菌菌落, 肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等, 鏡檢后初步判定來源于兩種不同菌株。菌株1在無機(jī)磷培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5天, 4 ℃培養(yǎng)6天, 直徑35—60 mm, 有不規(guī)則放射狀皺紋, 呈現(xiàn)兼絨狀, 菌絲無隔, 分生孢子結(jié)構(gòu)較少, 分生孢子面呈豆綠色, 反面呈現(xiàn)不同程度的赭黃色, 初步判斷為青霉菌。菌株2在無機(jī)磷培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5天, 4 ℃培養(yǎng)10天, 直徑45—65 mm, 同心圓狀分布, 呈現(xiàn)兼絨狀, 菌落中心淡黃褐色, 菌落最外圍呈灰綠色; 菌絲有隔, 分生孢子結(jié)構(gòu)較多, 分生孢子面呈藍(lán)綠色, 反面呈現(xiàn)不同程度的赭黃色, 初步判斷為青霉菌。兩種菌株菌絲和孢子形態(tài)、分生孢子結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2 菌株復(fù)篩及其溶磷能力分析

菌落1和菌落2在不同磷源構(gòu)成的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中, 菌絲均聚集成球, 培養(yǎng)48 h后能觀察到微丸的形成, 15 d后在接種菌落2的Al-P液體培養(yǎng)基中觀察到直徑2.0—3.0 mm的真菌球; 兩個(gè)菌落的菌丸和菌球在顏色、大小和質(zhì)地上存在差異, 菌落2較菌落1生長(zhǎng)更快, 表現(xiàn)為菌落和菌絲更多。球團(tuán)的形成和結(jié)構(gòu)與孢子接種劑濃度、pH和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成、特定真菌菌株的遺傳屬性等廣泛因素有關(guān), pH值為5.0可刺激赭綠青霉球團(tuán)的生成[22]。

由圖2可知, 菌落1和菌落2對(duì)Ca-P的溶解能力明顯高于Fe-P和Al-P, 菌株1在9d時(shí)溶磷量最高(73.47 mg·L–1), 菌落2在12 d達(dá)到最高(30.72 mg·L–1); 菌落1對(duì)Fe-P和Al-P也有一定溶解能力, Fe-P溶解量從第9 d開始逐漸增高, 15 d達(dá)到30.93 mg·L–1, 15 d培養(yǎng)期后4 ℃冰箱保存至30 d達(dá)到峰值72.20 mg·L–1, Al-P溶解量也從12 d的2.05 mg·L–1增至15 d的 14.00 mg·L–1, 30 d達(dá)到峰值32.85 mg·L–1, 對(duì)Ca-P的溶解度則從73.47 mg·L–1降低至21.74 mg·L–1。菌落2在15 d內(nèi)對(duì)Fe-P和Al-P溶解能力較低(<5 mg·L–1), 30 d有大幅度增加, 分別達(dá)到35.19 mg·L–1、10.98 mg·L–1。

2.3 菌株鑒定

真菌菌株1的4個(gè)測(cè)序樣本均來自GD2樣點(diǎn)的培養(yǎng)菌落(GD2-1、GD2-4、GD2-6、GD2-8), 樣本序列在NCBI比對(duì)結(jié)果為微紫青霉(), 相似度100%, 登錄號(hào)KM268697.1。真菌菌株2的3個(gè)測(cè)序樣本分別來自GD1、GD2和GD4樣點(diǎn)的培養(yǎng)菌落(GD1-3、GD2-2、GD4-5), 樣本序列在NCBI比對(duì)結(jié)果為赭綠青霉(), 相似度100%, 登錄號(hào)KY977590.1。

3 討論

3.1 兩種菌株的分布、生理生化特性及其應(yīng)用研究

微紫青霉和赭綠青霉同屬青霉屬(), 在土壤中廣泛分布。目前, 對(duì)微紫青霉的研究相對(duì)較多, 在《中國(guó)真菌志(第35卷)青霉屬》、《中國(guó)真菌總匯》中均有相關(guān)表述, 而赭綠青霉未出現(xiàn)在其名錄中。

圖1 真菌菌落菌絲形態(tài)(a)、分生孢子結(jié)構(gòu)和分生孢子(b、c)

Figure 1 Mycelium morphology (a), conidia structure and conidia (b, c) of fungal colony

圖2 不同磷源的真菌溶磷量及發(fā)酵液pH值

Figure 2 The amount of phosphorus and the pH value in the solution among different phosphorus sources

表2 菌株分布、生理生化特性及應(yīng)用研究

3.2 菌株適用的土壤生境特征分析

貴州茶園土壤pH值介于3.8—6.5, 有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、速效磷含量分別在7.43—174.04 g·kg–1、0.09—5.60 g·kg–1、0.19—1.31 g·kg–1、0.21—166.01 mg·kg–1之間, 總體上看土壤有機(jī)質(zhì)、全氮含量較為豐富, 大部分處于第二次全國(guó)土壤普查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ級(jí)以上, 但普遍存在缺磷情況, 速效磷缺乏(Ⅴ級(jí))和很缺乏(Ⅵ級(jí))的土壤占比40%以上[17]。本研究中都勻市茶園土壤pH值在4.9—5.6之間, 貴定縣在3.6—5.1之間, 全磷含量均達(dá)到Ⅰ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(>1.0 g·kg–1), 速效磷含量處于Ⅰ級(jí)(很豐富, >40 mg·kg–1)和Ⅳ級(jí)(適宜, 5~—10 mg·kg–1)之間(表1), 初篩得到的溶磷真菌溶磷能力并不高(SPI<2), 在無機(jī)磷固體平板上迭代培養(yǎng)后其溶磷能力逐漸增強(qiáng)并穩(wěn)定(SPI>2), 具有明顯溶磷圈的溶磷菌株均來自貴定縣, 尤其是土壤速效磷含量處于Ⅰ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、pH為4.0的土壤。

3.3 土壤pH和磷素含量對(duì)真菌種類及數(shù)量的影響

多數(shù)研究認(rèn)為, 溶磷菌培養(yǎng)液pH與菌株溶磷量間存在顯著相關(guān)關(guān)系[38-39], 本研究中Ca-P液體培養(yǎng)基中接種菌落1微紫青霉菌的發(fā)酵液初始pH為8.2, 在15 d培養(yǎng)期內(nèi)pH均在4.5以上(圖2), 溶磷量與發(fā)酵液pH呈顯著負(fù)相關(guān)(=-0.88,<0.05); 但接種菌落2赭綠青霉菌的發(fā)酵液溶磷量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈緩慢增加趨勢(shì), 至12 d達(dá)到最高值30.72 mg·L–1(圖2), 遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)[40]的65.81 mg·L–1, 與pH也沒有顯著的相關(guān)關(guān)系, 或與赭綠青霉菌在Ca-P液體培養(yǎng)基中初期生長(zhǎng)較前者快速, pH值由8.2急劇降低至3.96有關(guān)(圖2), 該過程可能有較多有機(jī)酸分泌, pH在4.5—7.0之間或更有利于酸性茶園土壤中的真菌活化土壤難溶性磷。雖然真菌同時(shí)產(chǎn)生不同的有機(jī)酸會(huì)提高其溶解不溶性磷酸鹽的潛力[41], 但真菌活化土壤難溶性磷的能力還受到土壤特性、溶磷真菌與其它微生物間的交互作用、作物種類[10]、土壤磷吸附能力[42]、載體種類[43]等多種因素的影響。

在固體聚磷酸銨肥田間肥效滴灌(水肥一體化)試驗(yàn)基地, 未施入DMPP ( 3,4-二甲基吡唑磷酸鹽)的GD3樣點(diǎn)和配施0.5% DMPP的GD4樣點(diǎn)土壤全磷和速效磷含量沒有顯著性差異, 而pH差異顯著(<0.05, 表1), 兩者均未篩選到SPI高于2的微紫青霉, 僅在pH為4.0的GD4樣地篩選到1株具有明顯溶磷圈的赭綠青霉; GD2和GD4的pH同為4.0, GD2的速效磷含量(164.66 mg·kg–1)顯著高于GD4(52.02 mg·kg–1), 前者篩選到4株SPI大于2.1、具有較好溶磷能力的微紫青霉和1株赭綠青霉; GD5樣點(diǎn)pH低于4.0, 其速效磷含量達(dá)到了214.75 mg·kg–1, 并未篩選到有明顯溶磷圈的真菌, 表明在茶園土壤中施入一定量的磷肥、提高土壤速效磷含量有助于溶磷真菌種群的生長(zhǎng)和溶磷能力的增加, 極強(qiáng)酸性土壤環(huán)境更有利于累積土壤速效磷(pH與速效磷相關(guān)系數(shù)= –0.74,<0.05), 但pH過高和過低均會(huì)影響菌株溶磷能力[38], pH低于4.0或不利于真菌生長(zhǎng)。

3.4 微紫青霉制備真菌生物菌肥潛力分析

貴州地處亞熱帶地區(qū), 酸性土壤占土地面積70%以上, 土壤中Fe、Al等對(duì)磷強(qiáng)烈固定, 將溶磷真菌接種到土壤中, 是增加土壤中可溶性磷的可靠來源[44], 具有顯著的促生和增產(chǎn)作用[45-46]。目前, 對(duì)土壤溶磷真菌的研究主要集中于曲霉和青霉, 還包括一些藍(lán)狀菌[47], 多數(shù)溶磷菌株對(duì)Ca-P的溶解能力高于Fe-P、Al-P和磷礦粉[38, 48-49], 但對(duì)南方酸性土壤來說, 更期望篩選出對(duì)Fe-P和Al-P溶解能力較好的菌株。本研究篩選出微紫青霉()和赭綠青霉()2種菌株, 于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基(Ca-P)培養(yǎng)12 d后赭綠青霉的溶磷圈更大更明顯, SPI值高于微紫青霉, 但對(duì)Fe-P和Al-P的溶解能力弱于微紫青霉(圖2); 無機(jī)磷液體培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d, 微紫青霉對(duì)Ca-P、Fe-P和Al-P的溶磷量分別為73.47 mg·L–1、30.93 mg·L–1和14.00 mg·L–1, Pandey等人[50]認(rèn)為包括微紫青霉在內(nèi)的7種青霉菌在第15 d后磷溶解度會(huì)最大, 我們也發(fā)現(xiàn)無機(jī)磷液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至30 d, 微紫青霉對(duì)Fe-P和Al-P的溶磷量分別達(dá)到了72.20 mg·L–1、35.19 mg·L–1。30d培養(yǎng)期間微紫青霉的最高溶磷量高于趙小蓉等人[19]研究發(fā)現(xiàn)的最適條件時(shí)(NH4+-N為氮源)青霉菌1TCRiF5對(duì)Ca-P、Fe-P和Al-P的溶磷量(分別為69.70 mg·L–1、1.52 mg·L–1和12.86 mg·L–1); 高于龔明波等人[51]從非石灰性潮土作物根際篩選出的棘孢青霉()溶磷量(分別為26.42 mg·L–1、41.43 mg·L–1、31.26mg·L–1); 低于張建峰等人[39]從北方草場(chǎng)鹽堿地土壤中篩選到1株繩狀青霉P1()的對(duì)Ca-P和Al-P溶磷量(分別為1137.65 mg·L–1、96.02 mg·L–1)、高于其對(duì)Fe-P的溶磷量(15.34 mg·L–1), 可能與其高Ca-P底物含量(10 g·L–1)、菌株耐高鹽有關(guān)。江紅梅等人[46]從內(nèi)蒙古向日葵鹽堿地中篩選出1株草酸青霉(), 對(duì)Ca-P和Al-P的溶磷量分別達(dá)972 mg·L–1、988 mg·L–1, 該菌株能在7.5%Na Cl培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng), 與水稻土、黏性潮土、鹽潮土和石灰性潮土適配性較好?？傮w上, 微紫青霉對(duì)無機(jī)磷的溶解能力低于耐高鹽青霉菌, 但優(yōu)于其他青霉菌, 對(duì)Fe-P和Al-P具有較好溶解能力, 適用于茶園酸性土壤的微生物溶磷菌肥開發(fā)。

此外, 茶樹最適pH在5.0—5.5之間[52], 但酸雨、茶土淋溶富鋁、施肥、種植密度、種植年限、翻耕條件、高產(chǎn)及茶樹根際有機(jī)酸分泌等因素都會(huì)導(dǎo)致茶園土壤酸化, 致使土壤肥力降低、重金屬元素累積, 從而影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì), 且pH低于4.0也不利于微紫青霉生長(zhǎng)。生物炭因其孔洞結(jié)構(gòu)十分容易聚集營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有益微生物, 能讓土壤變得肥沃, 利于植物生長(zhǎng)。相關(guān)研究表明, 溶磷菌接種酸性土壤后, 施用生物炭的土壤溶磷菌數(shù)量是不施用的10.5—15.25倍, 并能顯著提高土壤pH值和速效磷含量, 起到活化土壤磷素作用[53]。因此, 利用生物炭做微紫青霉菌肥載體, 制備地區(qū)缺磷茶園的專用真菌肥料, 既能開發(fā)本地微生物菌種資源、提高土壤pH值, 也能在一定程度上活化酸性土壤中的難溶性Fe-P、Al-P, 滿足地區(qū)生態(tài)茶園建設(shè)需求。

4 結(jié)論

(1) 從研究區(qū)茶土中篩選到7個(gè)高效溶磷真菌菌落, 分屬2種不同菌株, 經(jīng)鑒定分別為微紫青霉()和赭綠青霉()。

(2) 液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)條件下, 接種微紫青霉菌和赭綠青霉菌均能有效溶解Ca3(PO4)2、Fe3(PO4)2和AlPO4, 在以Ca3(PO4)2為唯一磷源的上清液中培養(yǎng)15d, 其有效磷含量分別達(dá)73.47 mg·L–1、30.72 mg·L–1; 以Fe3(PO4)2為唯一磷源的上清液中培養(yǎng)至30d, 其有效磷含量分別達(dá)72.20 mg·L–1、35.19 mg·L–1; 以AlPO4為唯一磷源的上清液中培養(yǎng)至30 d, 其有效磷含量分別達(dá)32.84 mg·L–1、10.98 mg·L–1。微紫青霉對(duì)無機(jī)磷的溶解能力明顯優(yōu)于赭綠青霉。

(3) 微紫青霉菌作為溶磷微生物的菌種資源, 有望應(yīng)用于地區(qū)茶園土壤微生物肥料的制備中, 未來可考慮采用生物炭載體、調(diào)節(jié)茶土pH值等方式增加其溶磷能力, 改善土壤缺磷現(xiàn)狀。

[1] 魯如坤. 土壤磷素水平和水體環(huán)境保護(hù)[J]. 磷肥與復(fù)肥, 2003, 18(1): 4–8.

[2] 王昕, 李海港, 程凌云, 等. 磷與水分互作的根土界面效應(yīng)及其高效利用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2017, 23(4): 1054–1064.

[3] 林鄭和. 茶樹對(duì)缺磷的生理生化反應(yīng)與適應(yīng)[D]. 福州:福建農(nóng)林大學(xué), 2009.

[4] 盧仁駿, 嚴(yán)小龍, 黃志武, 等. 廣東省磚紅壤旱地土壤養(yǎng)分狀況的網(wǎng)室調(diào)查[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1992, 13(2): 74–80.

[5] ZHANG Lin, DING Xiaodong, CHEN Sanfeng, et al. Reducing carbon: phosphorus ratio can enhance microbial phytin mineralization and lessen competition with maize for phosphorus[J]. Journal of Plant Interactions, 2014, 9(1): 850–856.

[6] 柴小粉, 張林, 田芷源, 等. 玉米叢枝菌根真菌根外菌絲表面定殖細(xì)菌解磷功能鑒定[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2016, 22(4): 1031–1038.

[7] WANG Fei, SHI Ning, JIANG Rongfeng, et al. In situ stable isotope probing of phosphate-solubilizing bacteria in the hyphosphere[J]. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(6): 1689–1701.

[8] BERGKEMPER F, KUBLIK S, LANG F, et al. Novel oligonucleotide primers reveal a high diversity of microbes which drive phosphorous turnover in soil[J]. Journal of microbiological methods, 2016, 125: 91–97.

[9] 范丙全, 唐玉霞, 孟春香, 等. 長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤溶磷微生物的影響[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 1999, 3(3): 9–12.

[10] 殷中偉. 真菌溶磷相關(guān)基因的克隆與功能分析[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[11] 范丙全, 金繼運(yùn), 葛誠(chéng). 溶磷草酸青霉菌篩選及其溶磷效果的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 35(5): 525–530.

[12] 范丙全, 金繼運(yùn), 葛誠(chéng). 溶磷真菌促進(jìn)磷素吸收和作物生長(zhǎng)的作用研究[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2004, 10(6): 620–624.

[13] 趙小蓉, 林啟美, 李保國(guó). 溶磷菌對(duì)4種難溶性磷酸鹽溶解能力的初步研究[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2002, 42(2): 236–241.

[14] 周國(guó)蘭, 趙華富, 王校常, 等. 貴州茶園土壤養(yǎng)分調(diào)查分析[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(8): 116–120.

[15] 楊秀琴, 朱四喜, 蘇春花. 貴州湄潭茶園土壤肥力特征與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)科技論文在線, 2014: 1–5.

[16] 張小琴, 陳娟, 高秀兵, 等. 貴州重點(diǎn)茶區(qū)茶園土壤pH值和主要養(yǎng)分分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 28(1): 286–291.

[17] 趙華富, 周國(guó)蘭, 劉曉霞, 等. 貴州茶區(qū)土壤養(yǎng)分狀況綜合評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)土壤與肥料, 2012, (3): 30–34.

[18] 韓曉陽. 茶樹根際土壤氨氮轉(zhuǎn)化菌的分離、鑒定及效應(yīng)研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[19] 崔思真, 吳洵. 茶樹磷素營(yíng)養(yǎng)品種間差異的研究[J]. 中國(guó)茶葉, 1996(1): 15–17.

[20] 范臘梅, 何電源, 廖先苓. 茶園土壤中磷素狀態(tài)對(duì)茶葉品質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)茶葉, 1988 (2): 28–29.

[21] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000: 638.

[22] SARASWATHY A, HALLBERG R. Mycelial pellet formation byspecies due to exposure to pyrene[J]. Microbiological Research, 2005, 160(4): 375–383.

[23] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)孢子植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)真菌志[M]∥孔華忠.第三十五卷:青霉屬及其相關(guān)有性型屬. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 1–284.

[24] 馮昕. 基于蛋白質(zhì)組學(xué)的高抗銅微紫青霉菌銅抗性機(jī)制研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2018.

[25] XU Jian, CHEN Guoli, SUN Xuezhe, et al. Paths and determinants forto resist low and high copper[J]. Scientific Reports, 2015, 5(1): 10590.

[26] 劉德勝, 黃玉玲, 馬麗英, 等. 微紫青霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分和細(xì)胞毒活性[J]. 中成藥, 2016, 38(4): 830–834.

[27] SODEK J, HOFMANN T. A Pepsin-like Enzyme from[J]. Journal of Biological Chemistry, 1968, 243(2): 450–451.

[28] 郝輝, 陳芝飛, 宋金勇, 等. 微紫青霉(sw 09)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶降解煙梗果膠的條件優(yōu)化及產(chǎn)物分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 28(6): 2756–2762.

[29] KUNDU A, RAY R R. Production of intracellular β-xylosidase from the submerged fermentation of citrus wastes by Penicillium janthinellum MTCC 10889[J]. Biotech, 2013, 3(3): 241–246.

[30] 劉楊. 微紫青霉菌菌株GXCR和輔助材料對(duì)重金屬?gòu)U水處理的研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2007.

[31] 殷中偉, 范丙全, 任萍. 纖維素降解真菌Y5的篩選及其對(duì)小麥秸稈降解效果[J]. 環(huán)境科學(xué), 2011, 32(1): 247–252.

[32] 訾慧, 白洪志, 王惠, 等. 利用農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)青霉菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(5): 285–289.

[33] 馮蕾, 宋彥波, 徐曉立,等. 赭綠青霉Sp1菌株木聚糖酶最佳產(chǎn)酶條件及部分酶學(xué)特性研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 47(8):1606–1614.

[34]SHEDBALKAR U, DHANVE R, JADHAV J. Biodegradation of triphenylmethane dye cotton blue byMTCC 517[J]. Journal of Hazardous Materials, 2008, 157(2/3): 472–479.

[35] DEY P M, PATEL S, BROWNLEADER M D. Induction of alpha-galactosidase inby guar () gum[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2011, 17(3): 361–371.

[36]SHEDBALKAR U, JADHAV J P. Detoxification of malachite green and textile industrial effluent by[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2011, 16(1): 196–204.

[37] LACERDA E C M, MARCELA D P G B, DOS REIS T A, et al. Copper biosorption from an aqueous solution by the dead biomass of[J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2019, 191(4):247.

[38] 李豆豆, 尚雙華, 韓巍,等. 一株高效解磷真菌新菌株的篩選鑒定及解磷特性[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2019, 30(7): 2384-2392.

[39] 張建峰, 苗天瑤, 張嘉旭, 等. 1株溶磷真菌的分離鑒定及溶磷特性分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 45(12): 121–128.

[40] 楊艷華. 土壤解磷微生物的分離鑒定[D]. 鄭州: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[41] SCERVINO J M, MESA M P, IVANA D M, et al. Soil fungal isolates produce different organic acid patterns involved in phosphate salts solubilization[J]. Biology and Fertility of Soils, 2010, 46(7): 755–763.

[42] OSORIO N W, HABTE M. Soil phosphate desorption induced by a phosphate-solubilizing fungus[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2014, 45(4): 451–460.

[43] SHAHZAD S M, ARIF M S, RIAZ M, et al. Interaction of compost additives with phosphate solubilizing rhizobacteria improved maize production and soil biochemical properties under dryland agriculture[J]. Soil and Tillage Research, 2017, 174:70–80.

[44] SAHOO H R, GUPTA N. Phosphate-solubilizing fungi: impact on growth and development of economically important plants[M]∥Phosphate solubilizing microor-ganisms. Springer International Publishing, 2014: 87–111.

[45] 史發(fā)超, 殷中偉, 江紅梅, 等. 一株溶磷真菌篩選鑒定及其溶磷促生效果[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(11): 1333–1343.

[46] 江紅梅, 殷中偉, 史發(fā)超, 等.一株耐鹽溶磷真菌的篩選、鑒定及其生物肥料的應(yīng)用效果[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2018, 24 (3): 728–742.

[47] 曾齊, 王繼華, 隋海潮, 等. 大豆根際溶磷真菌的篩選、復(fù)配及包埋固定化回用效果[J]. 分子植物育種, 2019, 17(10): 3353–3363.

[48] JAIN R, SAXENA J, SHARMA V. Differential effects of immobilized and free forms of phosphate-solubilizing fungal strains on the growth and phosphorus uptake of mung bean plants[J]. Annals of Microbiology, 2014, 64(4): 1523–1534.

[49] MENDES G, FREITAS A, PEREIRA O. Mechanisms of phosphate solubilization by fungal isolates when exposed to different P sources[J]. Annals of Microbiology, 2014, 64(1): 239–249.

[50] PANDEY A, DAS N, KUMAR B, et al. Phosphate solubilization byspp. isolated from soil samples of Indian Himalayan region[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(1): 97–102.

[51] 龔明波, 范丙全, 王洪媛. 一株新的溶磷棘孢青霉菌Z32的分離、鑒定及其土壤定殖與溶磷特性[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2010, 50(5): 580–585.

[52] 楊向德, 石元值, 伊?xí)栽? 等. 茶園土壤酸化研究現(xiàn)狀和展望[J]. 茶葉學(xué)報(bào), 2015, 56(4): 189–197.

[53] 鄭慧芬, 曾玉榮, 王成己, 等. 生物炭對(duì)紅壤茶園溶磷細(xì)菌數(shù)量和土壤有效磷含量的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2018, 34(18): 114–118.

Screening, identification and analysis of phosphate-solubilizingin tea soil

PENG Yan1,*, SUN Xin1, ZHOU Peifu2, YANG Cheng1, ZENG Guangneng1, FAN Bailing1

1.Guizhou Minzu University Eco-Environment Engineering College, Guiyang 550025, China 2.Guizhou Minzu University School of Chinese Pharmacy, Guiyang 550025, China

In order to maintain the natural soil integrity, activate the use of soil insoluble phosphorus and provide seed resources for the preparation of microbial fertilizer, high efficient phosphate-solublizing fungi were screened from Duyun and Guiding famous tea gardens in Guizhou Province. The soluble phosphorus index (SPI), morphological characteristics and ITS rDNA sequence were used to screen and identify the strain. The inorganic phosphate-solubilizing ability of the strain in the liquid medium with calcium phosphate, iron phosphate or aluminum phosphate as the sole phosphorus source was determined by liquid shaking bed culture experiment. A total of 7 highly efficient phosphate-solubilizing fungal colonies, which belonged to two strains by morphological observation, were screened. The two strains were identified asand. After liquid medium inoculation and shaker culture for 15 days, the available phosphorus content ofwas 73.47 mg·L–1, 30.93 mg·L–1and 14.00 mg·L–1respectively in the supernatant with Ca3(PO4)2, Fe3(PO4)2or AlPO4as the only phosphorus source, and the dissolution of the latter two reached 72.20 mg·L–1and 32.84 mg·L–1respectively after being stored at 4℃ for 30 days. At the same time, the available phosphorus content ofwas 30.72 mg·L–1, 4.14 mg·L–1and 1.51 mg·L–1respectively during 15 days incubation period, and the latter two reached 35.19 mg·L-1and 10.98 mg·L-1respectively in 30 days.The ability ofto dissolve inorganic phosphorus is obviously better than that of, which is expected to be applied in the preparation of soil fungal fertilizer of phosphorus deficient tea gardens in the region.

tea gardens; phosphate-solubilizing fungi; phosphate-solubilizing ability;;

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.03.016

S154.3

A

1008-8873(2020)03-113-09

2000-00-00;

2000-00-00

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41563013); 貴州省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合基礎(chǔ)﹝2018)1074號(hào)); 貴州省教育廳青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目(黔教合KY字﹝2016)161號(hào)); 貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字﹝2013)2147號(hào))

彭艷(1983—), 女, 四川南充人, 博士, 副教授, 主要從事生物環(huán)境地球化學(xué)研究, E-mail:yan.jane.peng@gmail.com

彭艷, 孫鑫, 周培富, 等. 貴州兩處茶園溶磷青霉菌的篩選、鑒定及溶磷能力分析[J]. 生態(tài)科學(xué), 2020, 39(3): 113–121.

PENG Yan, SUN Xin, ZHOU Peifu, et al. Screening, identification and analysis of phosphate-solubilizingin tea soil [J]. Ecological Science, 2020, 39(3): 113–121.