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        柱前衍生-HPLC法對水蛭的指紋圖譜及其16種氨基酸含量測定研究

        2020-06-08 06:39:56顧念念索亞然喬藝涵王昭懿馮丹趙霞孟雪丹吳怡青李朝峰趙崇軍馬志強林瑞超鄒迪新
        環(huán)球中醫(yī)藥 2020年4期
        關(guān)鍵詞:水蛭游離乙腈

        顧念念 索亞然 喬藝涵 王昭懿 馮丹 趙霞 孟雪丹 吳怡青 李朝峰 趙崇軍 馬志強 林瑞超 鄒迪新

        水蛭藥材為水蛭科動物水蛭HirudonipponicaWhitman、螞蟥WhitmaniapigraWhitman或柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全體,具有破血通經(jīng),逐瘀消癥的功效[1]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,水蛭具有抗血栓、抗凝血、抑制腫瘤血管生成、抗癌轉(zhuǎn)移及抗炎抗菌等活性,主要有效成分為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及一些小分子化合物[2-3]。目前有關(guān)水蛭藥材的氨基酸測定報道較多,而用相似度結(jié)合模式識別的數(shù)據(jù)分析對水蛭藥材進行質(zhì)量評價較少。PITC衍生劑是目前廣泛使用的HPLC氨基酸分析方法,該方法方便、快速,生成的苯氨基硫甲酰衍生物單一、穩(wěn)定;紫外檢測(254 nm)靈敏度高,可達1 pmol,本實驗采用PITC柱前衍生法建立了水蛭藥材的HPLC游離氨基酸指紋圖譜和含量測定的研究方法,綜合指紋圖譜信息、聚類分析及主成分分析將藥材分為3類,結(jié)果表明該方法可為水蛭藥材質(zhì)量控制評價提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 儀器

        高效液相色譜儀(Waters 2695)包括2695四元梯度泵、自動進樣器、2489紫外檢測器、在線脫氣機、柱溫箱、Empower色譜工作站。FW-200型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司); KQ-3200B型數(shù)控超聲儀(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);電子分析天平(Mettler Toledo 公司);10-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司);GTR10-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司);雷磁pH計(上海儀電科學(xué)儀器有限公司)。

        1.2 藥材樣品與試藥

        水蛭藥材共18批,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定系楊瑤君老師鑒定為水蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman的干燥全體,藥材信息見表1。對照品(上海源葉生物科技有限公司)天門冬氨酸Asp(批號B21934)、谷氨酸Glu(批號B21916)、絲氨酸Ser(批號B21932)、甘氨酸Gly(批號B21915)、組氨酸His(批號B21938)、精氨酸Arg(批號B21920)、蘇氨酸Thr(批號B21933)、丙氨酸Ala(批號B21911)、脯氨酸Pro(批號B21914)、酪氨酸Tyr(批號B21924)、纈氨酸Val(批號B21936)、蛋氨酸Met(批號B21913)、異亮氨酸Ile(批號B21937)、亮氨酸Leu(批號B21925)、苯丙氨酸Phe(批號B21910)、賴氨酸Lys(批號B21922),上述對照品純度均大于98%;無水乙酸鈉(純度大于99%,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、乙腈、乙酸、正己烷色譜純(Fisher)、三乙胺(TEA)(批號BCBH3144V)、異硫氰酸苯酯(PITC)(批號BCBB1912V)、純水(娃哈哈純凈水)。

        表1 藥材批次信息

        1.3 HPLC色譜分析條件

        博納艾杰爾Venusil AA氨基酸分析專用柱(4.6×250 mm,5μm);流動相A:0.1 mol/L無水乙酸鈉(pH 6.5)-乙腈(93∶7),B:乙腈-水(4∶1);梯度洗脫(0~14 min,0~10% B;14~22 min,10%~20% B;22~37 min,20%~30.7% B;37~41 min,30.7%~31.6% B;41~48 min,31.6%~34% B),流速0.8 mL/min,柱溫40 ℃,檢測波長254 nm,進樣量10 μL。

        1.4 溶液的制備

        1.4.1 衍生溶液的配制 TEA乙腈溶液:TEA 1.4 mL,加乙腈8.6 mL,混勻;PITC溶液:取PITC 25μL,加乙腈2 mL混勻。

        1.4.2 標(biāo)準品溶液的制備 分別取氨基酸標(biāo)準品適量,精密稱定,加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解為適當(dāng)濃度的對照品儲備液,取貯備液適量于同一容量瓶中,加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度,搖勻,分別制成天門冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、絲氨酸Ser、甘氨酸Gly、組氨酸His、精氨酸Arg、蘇氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val、蛋氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、賴氨酸Lys質(zhì)量濃度分別為0.0670、0.3938、0.0532、0.0496、0.0260、0.0300、0.0550、0.3444、0.0428、0.0540、0.0858、0.0272、0.0612、0.0914、0.0666、0.0600 mg/mL的測定游離氨基酸樣品的混合對照品溶液;天門冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、絲氨酸Ser、甘氨酸Gly、組氨酸His、精氨酸Arg、蘇氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val、蛋氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、賴氨酸Lys質(zhì)量濃度分別為1.2304、1.6528、0.5928、0.6584、0.5588、0.7008、0.4076、0.7336、0.4956、0.5500、0.7340、0.2492、0.4588、0.9060、0.6692、1.0764 mg/mL的測定水解氨基酸樣品的混合對照品溶液。

        1.4.3 供試品溶液的制備 取水蛭藥材粉末(過40目篩)5 g,精密稱定,加入蒸餾水25 mL,搖勻,浸提45 min,超聲提取60 min(500 W,100 HZ),離心(5000 r/min)20 min,取上清液備用。 游離氨基酸樣品的制備:精密取上清液4 mL,加入12 mL乙腈,搖勻,過濾,殘渣加乙腈溶液(乙腈-水=3∶1)洗滌,減壓揮干溶劑后,0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 mL,0.45μm濾膜過濾即可。水解氨基酸樣品的制備:精密取上清液2 mL,加入6 mol/L鹽酸10 mL,搖勻,抽真空,氮氣密封,置110 ℃烘箱中水解24 小時,取出水解管冷卻后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中,水浴揮干鹽酸并水洗數(shù)次至鹽酸徹底揮干,0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 mL,0.45 μm濾膜過濾即可。

        1.4.4 標(biāo)準品和供試品的衍生 準確取氨基酸標(biāo)準溶液和樣品溶液200 μL,分別置于1.5 mL離心管中,加入TEA乙腈溶液和PITC乙腈溶液各100 μL至每個離心管,混勻,室溫放置1 小時,各加入正己烷400 μL,振搖后靜置10 min,取下層溶液,0.45 μm濾膜過濾,取濾液200 μL,加800 μL水稀釋,搖勻,進樣10 μL。

        1.5 方法學(xué)考察

        精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗表明相對峰面積RSD均小于3 %,符合標(biāo)準。

        2 結(jié)果

        2.1 指紋圖譜的建立與評價

        2.1.1 指紋圖譜的建立 將18批水蛭藥材色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(V2.0)進行分析處理,以S10號樣品色譜圖為參照圖譜,生成水蛭藥材氨基酸指紋圖譜(R),建立了水蛭藥材游離類氨基酸HPLC指紋圖譜,見圖1。

        2.1.2 共有峰的標(biāo)定與指認 根據(jù)18批藥材色譜圖,利用相似度軟件進行數(shù)據(jù)匹配,共標(biāo)定出25個色譜峰,并指認16個共有峰,見圖2,游離以及水解樣品圖譜見圖3。

        圖1 18批藥材游離氨基酸HPLC圖

        注:2:Asp;3:Glu; 6:Ser; 7:Gly; 8:His; 9:Arg; 10:Thr; 11:Ala; 12:Pro; 16:Tyr; 17: Val; 18: Met; 20:Ile; 21: Leu; 23: Phe; 25:Lys圖2 18批藥材對照圖譜

        注:1:Asp; 2:Glu; 3:Ser; 4:Gly; 5:His; 6:Arg; 7:Thr; 8:Ala; 9:Pro; 10:Tyr; 11: Val; 12: Met; 13:Ile; 14: Leu; 15: Phe; 16:Lys圖3 藥材水解樣品(A)、游離樣品(B)、混合氨基酸對照品(C)和空白(D)HPLC圖

        2.2 相似度評價

        采用相似度軟件對藥材的色譜圖進行相似度評價,結(jié)果18批藥材的相似度均>0.960,說明不同批次的藥材之間的游離氨基酸化學(xué)組成一致性較好,符合指紋圖譜的要求,可以建立共有模式。

        2.3 聚類分析

        將18批藥材的25個共有峰峰面積相對于進樣濃度標(biāo)準化作為變量導(dǎo)入SAS8.2軟件,以離均差平方和法對其進行聚類,結(jié)果見圖4。當(dāng)判別距離為6時,可以分為三類,S5、S6、S7、S8、S9、S10為一類,S1、S3、S11、S12、S14、S15、S17、S18為二類,S2、S4、S13、S16為三類,表明不同產(chǎn)地的水蛭成分含量存在一定的差異,同一產(chǎn)地水蛭藥材成分也存在差異,原因可能與水蛭生活環(huán)境,所食食物及采收加工方式有關(guān)。

        2.4 主成分分析

        分別以水蛭藥材游離氨基酸指紋圖譜中25個共有峰的峰面積為變量,采用SIMCA-13.0分析軟件進行主成分分析,并作主成分得分圖和載荷圖,見圖5、圖6。

        由圖5可知18批藥材可分為三類,S5、S6、S7、S8、S9、S10為第一類,S1、S3、S11、S12、S14、S15、S17、S18為第二類,S2、S4、S13、S16為第三類,與聚類分析結(jié)果一致。因子載荷是主成分與原始變量的相關(guān)系數(shù),由圖6可知P6 (Ser)、P7(Gly)、P10(Thr)離原點較遠,即載荷較大,表明這些共有峰在區(qū)分不同批次水蛭藥材中起著很大作用。

        圖4 18批藥材聚類分析圖

        圖5 18批藥材主成分得分圖

        圖6 18批藥材主成分載荷圖

        2.5 含量測定

        2.5.1 方法學(xué)考察 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗表明保留時間和峰面積RSD均小于3 %,重復(fù)性試驗除游離樣品His 、Met 的峰面積RSD為3.65 %、4.30%外,均小于3 %,線性關(guān)系考察r值在0.999 ~1.000之間,符合標(biāo)準,加樣回收率試驗中游離氨基酸的加樣回收率在98.43%~102.34%,RSD在1.71%~4.23%,水解氨基酸的加樣回收率在97.12%~101.26%,RSD在1.20%~3.77%。

        2.5.2 樣品的測定 取18批不同批次的水蛭藥材,按1.4項下方法制備供試品試液,按1.3項色譜條件測定,回歸方程進行計算,結(jié)果見表2、3。

        表2 游離氨基酸成分的含量測定結(jié)果(mg/g)

        表3 水解氨基酸成分的含量測定結(jié)果(mg/g)

        3 討論

        本實驗前期以色譜峰的數(shù)目、分離度、峰型等色譜參數(shù)為指標(biāo),比較了提取溶劑的量(20 mL,25 mL,30 mL)以及浸泡時間(30 min,45 min,60 min)和超聲時間(30 min,45 min,60 min),對供試品溶液制備方法進行了考察,最終確定25 mL水浸泡45 min,超聲60 min,5000 r/min離心20 min即可提取完全;并考察了不同流動相系統(tǒng)(5 %乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液 - 80 %乙腈水溶液,7%乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液-80%乙腈水溶液,10%乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液-80%乙腈水溶液),不同流速(0.6 mL/min,0.8 mL/min,1 mL/min),最終采用峰型較好、出峰時間合適的7%乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液-80%乙腈水溶液為流動相,流速為0.8 mL/min。

        本實驗收集了18批不同產(chǎn)地的水蛭藥材,建立了水蛭藥材的游離類氨基酸指紋圖譜,并較為全面地分析了18批藥材中16種氨基酸的含量,結(jié)果表明不同批次的水蛭藥材氨基酸含量差異很大,水解氨基酸中含量最高的Glu 含量范圍為7.26~18.36 mg/g,游離氨基酸中含量最高的Ala的含量范圍為1.43~ 4.39 mg/g。相似度評價分析發(fā)現(xiàn)18批藥材間相似度在0.960以上,說明藥材間質(zhì)量較穩(wěn)定,而由因子載荷分析可知Ser、Gly、Thr對不同批次水蛭藥材的區(qū)分有較大貢獻,含量測定結(jié)果結(jié)合聚類分析、主成分分析說明即使同一產(chǎn)地的藥材也存在一定的差異。在實驗條件下,游離氨基酸樣品和水解總氨基酸樣品中均未檢測出Cys,與文獻[4]報道一致。

        由于中藥指紋圖譜整體性和模糊性的特點,單純比較其相似度說服力弱[5],因此本實驗結(jié)合聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地的水蛭藥材進行質(zhì)量評價,從水蛭藥材氨基酸成分著手,較為全面地評價了水蛭藥材中氨基酸成分及其含量,建立了其指紋圖譜和含量測定方法,為水蛭藥材的后續(xù)研究提供一定的參考依據(jù)。

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