孫瑞茜 傅強 趙進(jìn)喜

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組常見的以葡萄糖和脂肪代謝紊亂、血漿葡萄糖水平增高為特征的代謝內(nèi)分泌疾病，其引發(fā)的一系列并發(fā)癥嚴(yán)重危害著人類健康。中醫(yī)藥治療2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)有較好的療效，課題組基于《內(nèi)經(jīng)》“壯熱食氣”的理論，結(jié)合長期的臨床觀察，提出T2DM的基本病機為熱傷氣陰，治療強調(diào)清熱益氣養(yǎng)陰法的應(yīng)用。

藥對是兩味藥的配伍運用，可使立方療效更彰，人參、黃連“藥對”是古代醫(yī)家常用的對藥，也是清熱益氣法的代表性藥物，唐代孫思邈的《千金方》里就有應(yīng)用人參、黃連“藥對”治療“消渴病”的記載，漢末年代的《名醫(yī)別錄》中也提到人參、黃連有“止消渴”的作用，可見古人對于人參、黃連“藥對”治療糖尿病早有認(rèn)識?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參、黃連“藥對”可以改善T2DM胰島素抵抗，保護(hù)胰島β細(xì)胞，其作用機制與下調(diào)胰島中促炎細(xì)胞因子、促凋亡因子的表達(dá)，以及上調(diào)調(diào)脂聯(lián)素受體的表達(dá)有關(guān)[1]，但其具體作用路徑仍不是十分清楚。中藥具有多成分、多靶點的特點，因為中藥方劑的復(fù)雜性，其機制研究比較困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)近來已經(jīng)成為一種高效、系統(tǒng)地揭示中藥方劑分子機制的新手段。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以將藥物作用所涉及的蛋白靶點納入一個龐大的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)中，通過分析這一生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，不僅可以發(fā)現(xiàn)藥物潛在蛋白靶標(biāo)及靶標(biāo)之間的相互作用，還可以發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)的功能以及對生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)的影響[2]，進(jìn)而尋找藥物的潛在作用通路，揭示中藥的配伍規(guī)律，尋找新的適應(yīng)癥，為中藥的現(xiàn)代化研究提供幫助。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā)，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫篩選人參、黃連“藥對”的主要作用成分及靶點，并與T2DM疾病靶點進(jìn)行匹配，篩選出人參、黃連“藥對”治療T2DM的潛在關(guān)鍵靶點，構(gòu)建藥物—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)，通過GO富集及通路富集分析人參、黃連“藥對”治療T2DM的潛在作用機制，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料及方法

1.1 人參、黃連“藥對”成分收集和篩選

使用TCMID(traditional Chinese medicine integrative database)、TCMSP平臺(version 2.3，traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)篩選人參、黃連兩味藥物化學(xué)成分。借助 TCMSP平臺的參數(shù)篩選活性成分，設(shè)定藥物成分口服生物利用度(oral bioavailability，OB) ≥30%，類藥性( druglikeness，DL) ≥0.18[3-4]。

1.2 人參、黃連“藥對”化合物靶點獲取

使用蛋白—化合物相互作用數(shù)據(jù)庫STITCH 5.0數(shù)據(jù)庫[5]及DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索候選活性成分靶點，限定物種為人，選擇高置信度的靶點(interaction score≥0.7)，剔除沒有靶點的活性成分, 建立化合物—作用靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 T2DM相關(guān)靶點檢索

基于TTD 數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database)、DrugBank數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫 (genetic association database)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“Type 2 Diabetes Mellitus”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選、整理T2DM相關(guān)靶點。

1.4 藥物—化合物—關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將人參、黃連的活性成分所對應(yīng)的靶點基因和T2DM相關(guān)的靶標(biāo)基因進(jìn)行匹配，獲得兩者的共同基因即為人參、黃連“藥對”治療T2DM的關(guān)鍵靶點。將靶點信息導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫, 獲得化合物—靶點蛋白相互作用關(guān)系，使用Cytoscape[6]軟件(Version 3.5.1)構(gòu)建“藥物—化合物—靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點表示靶點, 邊表示各靶點間的相互關(guān)系。

1.5 關(guān)鍵靶點GO分析及通路分析

DAVID數(shù)據(jù)庫整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析工具，可進(jìn)行基因本體(GO)分析和KEGG通路分析，從大規(guī)模的基因或蛋白序列中挖掘特定基因或蛋白的生物學(xué)意義[7]。設(shè)定P<0.05，GO富集分析選擇生物過程(biological process)和分子功能(molecular function)，通路富集分析選擇 KEGG數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 人參、黃連“藥對”活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出人參化學(xué)成分190個，黃連化學(xué)成分48個，從TCMID數(shù)據(jù)庫檢索出人參化學(xué)成分294個，黃連化學(xué)成分30個，剔除重復(fù)化學(xué)成分，并通過OB≥30%和DL≥0.18進(jìn)一步篩選得到人參的潛在活性成分29個，黃連潛在活性成分17個。

2.2 靶點收集

通過STITCH數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對應(yīng)的作用靶點，人參對應(yīng)的靶點有144個，黃連對應(yīng)的靶點有246個。通過DrugBank數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，共收集到350個2型糖尿病相關(guān)靶點。將人參、黃連活性成分靶點和T2DM靶點匹配后，得到42個人參、黃連“藥對”治療T2DM潛在靶點。見表1。

2.3 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建

2.3.1 藥物—化合物—靶點網(wǎng)絡(luò) 將人參、黃連兩味藥物與其活性成分及關(guān)鍵靶點基因?qū)隒ytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化。見圖1。結(jié)果表明，人參、黃連“藥對”直接與疾病靶點基因相連的活性成分有12個。其中槲皮素(quercetin)、黃連素(berberine)、山奈酚(kaempferol)、花生四烯酸(arachidonate acid)、阿魏酸(ferulic acid)、豆甾醇(stigmasterol)等6個成分能與3個及以上的關(guān)鍵靶點基因相連，可能是人參、黃連“藥對”治療2型糖尿病的重要成分。同時，多個化合物又可以具有共同靶點，人參、黃連的共同靶點有15個，分別為VEGFA、UGT1A9、UGT1A3、UGT1A1、TNF、SLC2A4、PTGS2、PTGS1、CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2、CYP1A1、AHR、ABCC1、ABCB1。

表1 人參、黃連“藥對”活性成分治療T2DM潛在靶點

圖1 人參、黃連“藥對”活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.2 關(guān)鍵靶點基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將人參、黃連治療T2DM的41個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲取蛋白相互作用關(guān)系，再導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖共包括42個節(jié)點，229個邊。以連接度(Degree)數(shù)值反映節(jié)點的大小，Degree指與該節(jié)點相關(guān)聯(lián)邊的條數(shù)。Degree數(shù)值越大，節(jié)點越大，表明這些靶點參與可更多的生物功能，在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位。其中Degree值前五名的靶點有CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、TNF、VEGFA。為了進(jìn)一步篩選出具有拓?fù)渲匾缘闹饕?jié)點，計算了網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的3個拓?fù)涮卣鳎篋egree、介度(Betweenness)和緊密度(Closeness)。Degree、Betweenness和Closeness的中值分別為12、0.017和0.516。確定Degree>12、Betweenness>0.017和Closeness>0.516的節(jié)點為主要節(jié)點，這些節(jié)點可能在人參、黃連“藥對”治療T2DM中具有重要意義，共篩選出25個主要靶點，以這些節(jié)點構(gòu)建基因調(diào)控蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物過程、分子功能和通路富集分析。見表2。

表2 核心靶點及拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖2 人參、黃連“藥對”治療T2DM靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO分析及通路富集分析

對人參、黃連的25個核心靶點進(jìn)行GO富集和KEGG 通路分析，選擇P<0.05的結(jié)果。生物過程富集結(jié)果見圖3，可見靶點關(guān)聯(lián)的生物過程主要有藥物代謝過程(7個靶點)、外源化合物代謝過程(8個靶點)、外源性藥物分解過程(5個靶點)、類固醇代謝途徑(6個靶點)等。主要相關(guān)的靶點為CYP3A4及其亞型CYP1A1、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C8、CYP1A2等。

分子功能富集結(jié)果見圖4，人參、黃連“藥對”核心靶點關(guān)聯(lián)的生物過程主要有氧結(jié)合、咖啡因氧化酶活性、酶結(jié)合、單加氧酶活性、血紅素結(jié)合、類固醇羥化酶活性、芳香化酶活性等，表明人參、黃連“藥對”可以通過參與調(diào)控多種生物學(xué)功能發(fā)揮作用。

對人參、黃連核心靶點進(jìn)行KEGG 通路富集,富集結(jié)果見圖5，核心靶點富集到的信號通路有 AMPK信號通路(4個靶點)、NF-κB信號通路(3個靶點)、TNF信號通路(3個靶點)以及胰高血糖素信號通路(3個靶點)，可見人參、黃連“藥對”可通過多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮治療T2DM作用。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是中藥研究的新技術(shù)、新方法，其研究理念與中醫(yī)“整體觀”的思想不謀而合，十分適用于中藥復(fù)方的研究?，F(xiàn)在，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥藥理機制研究、新藥發(fā)現(xiàn)以及不良反應(yīng)、毒副作用研究等方面均取得了良好成果[8]

本次研究發(fā)現(xiàn)人參、黃連“藥對”的主要活性成分中槲皮素、黃連素、山奈酚、花生四烯酸、阿魏酸、豆甾醇等擁有較多的預(yù)測靶點，表明這些化合物可能是人參、黃連“藥對”中產(chǎn)生藥理作用的重要化合物。其中黃連素治療T2DM的機制已有很多研究，黃連素能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞的修復(fù)和再生，活化胰島素受體基因的表達(dá)、增加胰島素敏感性，能夠提高糖尿病大鼠胰高糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide 1，GLP-1)水平及胰島β細(xì)胞的數(shù)量[9]，還可以調(diào)控多個信號通路。

圖3 人參、黃連“藥對”核心靶點生物學(xué)過程富集分析

圖4 人參、黃連“藥對”核心靶點分子功能富集分析

圖5 人參、黃連“藥對”核心靶點KEGG通路富集分析

將獲得的人參、黃連的25個核心靶點進(jìn)行GO分析和通路分析。GO分析和通路富集結(jié)果均顯示人參、黃連“藥對”治療T2DM的作用與CYP3A4及其亞型介導(dǎo)的藥物代謝有關(guān)。CYP3A4是參與人體藥物代謝的主要酶系，約占人體肝、腸、腎藥物代謝總反應(yīng)的75%，其代謝速度影響化合物的藥代動力學(xué)，也可能影響藥效反應(yīng)[10]，研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下一些藥物的藥動學(xué)會發(fā)生改變，可能與CYPs酶活性改變有關(guān)[11]。而中藥可以通過誘導(dǎo)或抑制CYP3A4的活性, 加速或減慢其他藥物在體內(nèi)的代謝[12]。進(jìn)一步研究人參、黃連對CYPs酶活性作用可能對研究藥物相互作用、避免不良反應(yīng)、促進(jìn)合理用藥具有重要臨床意義。

此外，人參、黃連“藥對”的核心靶點也和多個信號通路相關(guān)，其中TNF、PTGS2、IL1B是NF-κB信號通路、TNF信號通路的共同靶點。NF-κB通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要信號通路, 可以引起TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)，導(dǎo)致系列非特異性炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步引起胰島素抵抗和糖代謝異常。靶點IGF1R、HNF4A、CFTR、SIRT1富集在AMPK信號通路上，AMPK通路是預(yù)防代謝綜合征的重要通路，具有調(diào)節(jié)糖原異生和周圍組織的葡萄糖利用功能[13]。一線降糖藥二甲雙胍發(fā)揮生物活性與激活A(yù)MPK通路密切相關(guān)，二甲雙胍也可以抑制糖尿病大鼠骨骼肌TLR4/NF-κB/TNF-α炎癥信號通路，增加胰島素敏感性[14]。

分析結(jié)果顯示，人參、黃連“藥對”改善胰島素抵抗的作用與PPARA、 TNF、 SLC2A2等靶點相關(guān)，PPARA的活化可以降低葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá),抑制血管損傷、脂毒性、炎癥、血管生成和血栓形成介質(zhì)的產(chǎn)生[15], 還有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用[16]。臨床上貝特類藥物是PPARA受體激動劑,可治療血脂紊亂和T2DM。SLC2A2編碼的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2在胰島β細(xì)胞、肝、腸、腎以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，可以幫助肝臟發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)的功能, 參與刺激胰島素分泌過程，和空腹血糖受損高膽固醇血癥以及心血管疾病、T2DM的風(fēng)險增加關(guān)系密切[17]，是糖尿病藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對人參、黃連“藥對”進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了主要活性成分及其潛在作用靶點，通過靶點和通路分析討論了其治療T2DM的作用機制，但仍需要進(jìn)一步實驗數(shù)據(jù)的支持。此外，本研究也揭示了人參、黃連“藥對”多成分、多靶點和多通路的協(xié)同作用的特點，符合中藥方劑多組分、多功效、協(xié)同作用的特點，為進(jìn)一步深入研究人參、黃連“藥對”治療T2DM的活性成分和作用機制提供了重要的線索和依據(jù)。