趙霞 趙崇軍 魏紫櫻 韓志偉 鄒迪新 林瑞超

馬錢子在歷代應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用，有效亦有毒，馬錢子中毒事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用[1-2]。馬錢子歸肝經(jīng)，有文章報(bào)道長期服用可導(dǎo)致肝腎功能異常。因此本試驗(yàn)主要利用斑馬魚模型研究馬錢子肝毒性機(jī)制[3-4]。在前期研究中，主要是利用斑馬魚的肝臟表型對(duì)由馬錢子的肝臟毒性進(jìn)行了定性評(píng)價(jià)[5]，本研究的目的是利用斑馬魚肝臟形態(tài)、肝功能、生理參數(shù)及肝臟毒性相關(guān)基因的表達(dá)水平來定量評(píng)價(jià)馬錢子對(duì)斑馬魚肝臟的影響。這是首次對(duì)斑馬魚中馬錢子誘導(dǎo)的肝毒性進(jìn)行初步、系統(tǒng)的研究，可為馬錢子的肝毒性機(jī)制提供有價(jià)值的見解。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

動(dòng)物：AB系斑馬魚，購自中國斑馬魚資源中心(武漢)，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)。

儀器：蔡司體視熒光顯微鏡(Zeiss Axio Zoom V16)，LRH-250Z型恒溫生化培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)，RJLDL-50G型離心機(jī)(無錫瑞江分析儀器有限公司)，微型漩渦混懸(WH-90A，上海振榮科學(xué)儀器有限公司)，滅菌鍋(MLS-3751L，日本panasonic公司)，Epoch 酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，UV-2000紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)，HQ10-20H超純水儀(長沙聚豐環(huán)保科技有限公司)，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京東方科技發(fā)展有限公司)，凝膠電泳(NanoDrop 2000)，CFX96 Touch Systems (bio-rad, USA)，TransStart Top Green qPCR Super Mix (TransGen Biotech)。

材料：馬錢子(編號(hào)#160611)由安國圣山藥業(yè)有限公司提供。油紅O(s19039-100g)，吖啶橙(s47568-5g)，4%多聚甲醛(p1110)購置于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。SOD試劑盒(A001-3)、CAT試劑盒(A007-1)、AST試劑盒(C010-2)、ALT試劑盒(C009-2)、MDA試劑盒(A003-4)均購置于南京建成生物工程研究所，Bradford蛋白定量試劑盒(W042)(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。PBS緩沖液(21-040-CVR)(Corning，美國)。M3-氨基苯甲酰胺麻醉(MESAB-22)購置于美國密蘇里州圣路易斯西格瑪奧德里奇公司。H2O2購于北京化工廠，甲酰胺，SSC緩沖液(pH=7.0)購于北京生物技術(shù)有限公司。1，2-丙二醇溶液(中國廣東西龍科學(xué)有限公司)。RNA保護(hù)液、TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒均購于日本Takara，(Takara，日本東京)。FastKing RT試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。斑馬魚特異性PCR(北京博基因技術(shù)有限公司)。NaCl、KCl、CaCl2、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3均為分析純，購置于北京化工，移液器(德國Eppendorf公司)，12孔板(Corning，美國)。

1.2 斑馬魚

本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的所有斑馬魚相關(guān)實(shí)驗(yàn)都是根據(jù)《中華人民共和國科技部動(dòng)物管理辦法》，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后所進(jìn)行的。斑馬魚培養(yǎng)條件為：暗/光周期為10：14小時(shí)。水產(chǎn)養(yǎng)殖條件需要控制[溫度(28.5±0.5)℃，pH值7.0～7.4,導(dǎo)電率480～510 μS/cm，硬度50～70 mg/L(CaCO3)]。斑馬魚胚胎是以1∶1的雌雄比(5～8月齡)自然配對(duì)交配產(chǎn)生，28.5℃下在胚胎培養(yǎng)水中進(jìn)行孵育，并且實(shí)驗(yàn)開始前需在蔡司立體熒光顯微鏡下取出死亡和未受精的胚胎。

1.3 樣本的制備

馬錢子(50.0 g)粉碎后過40目篩，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2小時(shí)。過濾后，將殘?jiān)谜麴s水重復(fù)上述操作提取2次，每次1小時(shí)。3次回流上清液混合，過濾、離心(3000g)30分鐘，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行減壓濃縮。并在室溫下真空干燥。獲得的干燥提取物在干燥器中保存直到使用為止。使用時(shí)用胚胎培養(yǎng)水將提取物復(fù)溶，配置成實(shí)驗(yàn)所需母液(400 μg/mL)，然后稀釋至工作濃度。

1.4 斑馬魚暴露

選取健康正常的3天的斑馬魚幼魚，置于12孔微板中，每孔20條。4天時(shí)，快速吸取胚胎培養(yǎng)水并加入4 mL不同濃度的暴露液。對(duì)照組均用等量的新鮮胚胎水平行處理。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔，每個(gè)培養(yǎng)板由5個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組組成。如果對(duì)照組胚胎的死亡或畸形率>10%，則該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為無效而終止。實(shí)驗(yàn)暴露過程中的溫度、濕度、光周期等外界條件與培養(yǎng)環(huán)境相同。

1.5 量毒曲線評(píng)價(jià)

為了建立致死曲線，在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，對(duì)不同處理組中存活的斑馬魚進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了三次。得到死亡率曲線，并用Logistic回歸分析計(jì)算LC10(SPSS統(tǒng)計(jì)為Windows，Version 17.0)。

1.6 肝臟形態(tài)和生理參數(shù)的評(píng)估

在亞致死濃度條件下(

參考已發(fā)表文章，以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)等肝功能指標(biāo)及相關(guān)生理指標(biāo)確認(rèn)馬錢子對(duì)斑馬魚幼魚的肝毒性[6-7]。在暴露終點(diǎn)，從不同處理組中隨機(jī)抽取80條斑馬魚，用清水洗兩次，轉(zhuǎn)移到1.5 mL升離心管中；將斑馬魚置于冰水中進(jìn)行安樂死，每個(gè)樣品加10倍體積PBS冰浴勻漿，離心(3000g，10分鐘)。收集上清液，根據(jù)相應(yīng)檢測(cè)試劑盒中提供的指示測(cè)定上清液中SOD、CAT、ALT、AST活性及MDA含量，整個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

1.7 油紅O染色觀察肝臟脂肪

在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，用胚胎水沖洗兩次，固定在4%多聚甲醛中，4℃條件下過夜。隨后PBS洗滌，用含6 mL無菌水、3.3 mL 30%的H2O2、0.5 mL甲酰胺和0.25 mL SSC緩沖液(pH=7.0)的溶液處理。隨后，PBS中洗滌后，依次在85%和100%的1，2-丙二醇溶液中浸泡10分鐘，然后在0.5%新配置的油紅O中并在室溫黑暗中過夜染色。隨后，將斑馬魚分別用100%和85%的1，2-丙二醇洗30分鐘左右，再用PBS洗兩次。斑馬魚在80%的1，2-丙二醇中貯藏，顯微鏡明亮視野成像拍攝。油紅O染色的所有步驟在室溫下慢速搖床上進(jìn)行。當(dāng)肝臟與周圍組織之間有明顯的細(xì)線且肝臟內(nèi)可見3個(gè)以上的脂滴時(shí)，認(rèn)為該結(jié)果為脂肪變性陽性[8-9]。

1.8 吖啶橙染色觀察凋亡細(xì)胞

吖啶橙染色法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，可用于檢測(cè)斑馬魚幼魚中的凋亡細(xì)胞[10]。將暴露處理后的幼魚用胚胎水沖洗三次，并暴露在含5 μg/mL吖啶橙的胚胎水中，避光處理20分鐘。去除吖啶橙溶液后，用PBS溶液沖洗2次后，將斑馬魚樣本置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.9 RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR(Q-RT-PCR)檢測(cè)

樣品制備：每組隨機(jī)抽取40條斑馬魚，用胚胎水沖洗2次，轉(zhuǎn)移到含有1 mL RNA保護(hù)液的1.5 mL離心管中，儲(chǔ)存在-20℃。用TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA。通過凝膠電泳和紫外分光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性。采用FastKing RT試劑盒將各組等量的總RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。采用CFX96 Touch Systems與TransStart Top Green qPCR Super Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。所有步驟均按照制造商提供的不同試劑盒說明進(jìn)行。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了斑馬魚特異性PCR引物。兩步PCR擴(kuò)增協(xié)議如下：95°C 3分鐘，60°C循環(huán)40次，20秒，95°C 15秒，60°C 10秒，95℃ 15秒。見表1。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 急性毒性評(píng)價(jià)

在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，通過統(tǒng)計(jì)不同處理組中存活的斑馬魚數(shù)目來計(jì)算其死亡率，進(jìn)而獲得馬錢子對(duì)斑馬魚幼魚的量毒曲線。結(jié)果表明200 μg/mL或更高濃度馬錢子處理24小時(shí)后，斑馬魚全部死亡。80 μg/mL以下暴露致斑馬魚的死亡率接近0%，對(duì)照組死亡率最低(死亡率<10%)。不同處理組中斑馬魚幼魚的死亡率如圖1顯示。結(jié)果表明，隨著暴露濃度的增加，斑馬魚幼魚的死亡率呈濃度依賴性增加。由于劑量效應(yīng)，根據(jù)死亡率曲線計(jì)算得到馬錢子對(duì)斑馬魚幼魚LC10為76.523 μg/mL。見圖1。

2.2 馬錢子對(duì)肝臟形態(tài)學(xué)的影響

通過三個(gè)特定的表型終點(diǎn)(肝臟變性，肝臟大小的變化和卵黃囊保留)來評(píng)估肝毒性[11]。對(duì)照組中可明顯觀察到斑馬魚肝臟與周圍組織的邊界清晰，肝臟灌注循環(huán)血細(xì)胞，見圖2(d)。與對(duì)照組相比，馬錢子誘導(dǎo)使肝臟變暗，肝組織輪廓模糊，表明肝臟變性和/或壞死[12]。見圖2。

圖1 不同濃度馬錢子提取物處理24小時(shí)后斑馬魚幼魚的量毒曲線

2.3 肝臟表型的定量分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下用20條斑馬魚幼魚評(píng)價(jià)肝臟面積和光密度，通過肝臟大小和光密度的變化來定量評(píng)價(jià)馬錢子的肝臟毒性?？瞻讓?duì)照組及不同濃度藥液處理24小時(shí)后，在暴露終點(diǎn)，隨著濃度的增加，處理組中肝臟面積和光密度呈濃度依賴性增加，并且與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.01)。見表2。

注：(a)馬錢子暴露組斑馬魚幼魚肝臟組織退化，卵黃囊保留；(b)馬錢子暴露組斑馬魚幼魚肝臟腫大；(c)馬錢子暴露組斑馬魚幼魚肝臟顏色較深；(d)空白對(duì)照組肝臟清晰、健康。L：肝臟；Y：卵黃囊圖2 馬錢子提取物處理斑馬魚幼魚24小時(shí)后肝臟形態(tài)學(xué)變化(×50)

表2 馬錢子處理24小時(shí)后斑馬魚幼魚肝臟表型(肝臟面積和光密度)

注： 與空白對(duì)照組比較，表示aP<0.01。

2.4 酶活性測(cè)定

每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下用80條斑馬魚評(píng)價(jià)肝功能和生理參數(shù)，為進(jìn)一步評(píng)估肝臟損害，在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，利用試劑盒對(duì)肝功能(ALT/GPT，AST/GOT)，和一系列的生化指標(biāo)(MDA，SOD，CAT)進(jìn)行評(píng)價(jià)[15-16]。與對(duì)照組相比，中、高劑量組CAT活性下降，并具有極顯著差異(P<0.01)，低劑量組CAT酶活性有顯著差異(P<0.05)。與對(duì)照組相比，馬錢子暴露組中SOD活性低于對(duì)照組，并具有極顯著差異(P<0.01)。與對(duì)照組相比，中、高劑量組MDA活性升高，并具有極顯著差異(P<0.01)，低劑量組MDA活性升高，有顯著差異(P<0.05)。與對(duì)照組相比，中、高劑量組ALT/GPT活性升高，并具有極顯著差異(P< 0.01)。低濃度處理對(duì)ALT/GPT 活性無明顯影響。與對(duì)照組相比，馬錢子暴露組AST/GOT活性高于對(duì)照組，并具有極顯著差異(P<0.01)。見表3。

2.5 全脂油紅O染色和吖啶橙染色

油紅O能與斑馬魚幼魚中性脂結(jié)合[13]。染色結(jié)果顯示，處理組肝臟中的脂質(zhì)含量與對(duì)照組相比有顯著性差異，見圖3(a)，表明用馬錢子處理的幼魚發(fā)生了脂肪變性，見圖3(b)黑色箭頭。

吖啶橙作為一種異色染料，可與凋亡細(xì)胞中的DNA發(fā)生反應(yīng)，發(fā)出綠色熒光，通過這種熒光可以有效快速地識(shí)別凋亡細(xì)胞的確切區(qū)域，因此被廣泛用于檢測(cè)包括斑馬魚模型在內(nèi)的不同組織中的細(xì)胞凋亡[14]。如早期研究所述，低濃度的馬錢子提取物可引起斑馬魚幼體細(xì)胞凋亡(

2.6 氧化應(yīng)激與馬錢子肝毒性的關(guān)系

越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激損傷與中草藥相關(guān)肝損傷(herb-induced liver injury，HILI)的發(fā)生密切相關(guān)。實(shí)時(shí)定量PCR(Q-RT-PCR)結(jié)果表明，和空白對(duì)照組相比，馬錢子暴露處理能夠顯著引起超氧化物歧化酶1(superoxidedismutase1，sod1)、醌氧化還原酶1(nad(p)hquinoneoxidoreductase1，nqo1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P 2(glutathiones-transferasep2，gstp2)、B細(xì)胞淋巴瘤2(b-celllymphoma-2，bcl-2)基因表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，具有顯著性(見表4)，而谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P 2(glutathiones-transferasep2，gstp2)基因的表達(dá)水平僅以濃度方式降低，該結(jié)果與前期研究是極其相似的。然而，暴露對(duì)線粒體解偶聯(lián)蛋白2基因(uncouplingprotein2，ucp2)的表達(dá)水平無顯著影響。見表4。

2.7 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因與馬錢子致肝毒性的關(guān)系

細(xì)胞凋亡是各種急、慢性肝損傷發(fā)生后期的共同特征。研究表明，線粒體凋亡途徑受BCL-2家族[17]的調(diào)控。bcl-2和骨髓細(xì)胞白血病-1B基因(myeloidcellleukemia-1b，mcl-1b)是抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活的兩個(gè)關(guān)鍵基因。BH3互動(dòng)死亡激動(dòng)劑基因(recombinantBH3interactingdomaindeathagonist，bid)和BCL 2關(guān)聯(lián)X蛋白基因(Bcl 2associatedX,apoptosisregulator，bax-2)對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。Q-RT-PCR結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，馬錢子處理可使bid表達(dá)增加4至6倍，mcl-1b則可增加1至2倍，引起bid和mcl-1b基因表達(dá)水平的提高，bax-2表達(dá)水平下降，bcl-2表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。見表5。

表3 馬錢子處理24小時(shí)后對(duì)斑馬魚幼魚肝臟功能和生理參數(shù)的影響

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.01，bP<0.05。

注：(a)空白對(duì)照組油紅O染色；(b)30 μg/mL馬錢子提取物暴露組油紅O染色。脂肪變性(黑色箭頭，30×)；(c)空白對(duì)照組吖啶橙染色；(d)30 μg/mL馬錢子提取物暴露組吖啶橙染色。圖3 油紅O染色和吖啶橙染色(×50)

表4 空白對(duì)照組及不同濃度給藥組處理24小時(shí)后斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的變化

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.01。

表5 空白對(duì)照組及不同濃度給藥組處理24小時(shí)后斑馬魚幼魚細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.01，bP<0.05。

表6 空白對(duì)照組及不同濃度給藥組處理24小時(shí)后斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.01，bP<0.05。

2.8 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因與馬錢子致肝毒性的關(guān)系

為了從基因水平了解馬錢子的肝臟毒性機(jī)制，應(yīng)用Q-RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織脂肪代謝和纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括肝纖維化相關(guān)基因成纖維細(xì)胞活化蛋白α基因(fibroblastactivationproteinalpha，fabp)、瘦素受體基因(leptinreceptor，lepr)、視黃醇結(jié)合蛋白4基因(retinolbindingprotein4，rbp4)、轉(zhuǎn)化生長因子基因(transforminggrowthfactorbeta1，tgf-β1)及其受體轉(zhuǎn)化生長因子β受體2基因(transforminggrowthfactorbetareceptor2，tgf-βr2)的表達(dá)，結(jié)果見表6。研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，隨著馬錢子濃度的增加，tgf-β1表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.0 5)。與tgf-β1類似，低、中劑量組中rbp4表達(dá)水平顯著升高(P<0.0 1)。 而馬錢子暴露導(dǎo)致3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coareductase，hmgcra)表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，并具極顯著差異(P<0.0 1)。此外，高濃度處理可導(dǎo)致大多數(shù)基因表達(dá)水平下降。 結(jié)果提示肝脂肪變性和纖維化可能與調(diào)節(jié)tgf-β1、rbp4和hmgcra的表達(dá)有關(guān)。

3 結(jié)論

近年來，馬錢子的生物活性作用及活性成分的研究較多，對(duì)馬錢子毒性機(jī)制的研究較少。本研究首次報(bào)道了馬錢子的體內(nèi)肝臟毒性機(jī)制，結(jié)果表明，馬錢子誘導(dǎo)可破壞斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)，擾亂脂肪代謝平衡，引起細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肝臟損傷。本研究首次證實(shí)了斑馬魚肝臟毒性研究的有效性和可預(yù)測(cè)性，為馬錢子的肝毒性研究提供了補(bǔ)充資料。然而，心臟等其他重要器官對(duì)馬錢子肝臟毒性作用的影響，馬錢子肝毒性機(jī)制在斑馬魚與哺乳動(dòng)物之間的物種保守性還有待進(jìn)一步研究。在未來，我們將采用一種基于組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的方法來研究馬錢子的系統(tǒng)生物學(xué)特性、中草藥化學(xué)特性與生物學(xué)特性的關(guān)系。

最近，越來越多的報(bào)道表明，HILI評(píng)價(jià)的最佳策略是建立一個(gè)完整的評(píng)估體系和一個(gè)合適的動(dòng)物模型來預(yù)測(cè)藥物潛在的肝毒性[18]，斑馬魚幼魚可為HILI[19-20]的篩選策略提供極大的附加值。總之，它可以作為體內(nèi)模型和體外模型之間的橋梁，將完整的生物復(fù)雜性和高通量篩選能力結(jié)合起來[21]。

本研究首次利用斑馬魚評(píng)估了馬錢子的急性毒性。在亞致死濃度(

最后，通過檢測(cè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)馬錢子的肝毒性機(jī)制進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明抗氧化和解毒酶基因[26]，比如sod1、bcl-2、gstp2和nqo1基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)馬錢子的肝毒性部分是由于抗氧化活性紊亂所致。此外，bid基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)。相反，mcl-1b基因的表達(dá)水平增加，這可能是自我保護(hù)表達(dá)的結(jié)果，但其表達(dá)增加水平遠(yuǎn)低于bid基因的表達(dá)量，說明斑馬魚的自我保護(hù)能力遠(yuǎn)不能阻止細(xì)胞的凋亡過程。此外，tgf-β1和rbp4基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)出濃度依賴性增加的趨勢(shì)，而hmgcra基因表達(dá)水平下降。此外，高濃度處理使大多數(shù)基因表達(dá)水平下降。提示肝組織脂肪變性和纖維化可能與上調(diào)肝組織tgf-β1基因的表達(dá)有關(guān)，因此，馬錢子對(duì)斑馬魚幼魚的肝毒性可能是通過脂肪變性、纖維化-凋亡途徑介導(dǎo)的。