戴媛媛 高 寒 劉嫦欽 劉占舉 孫曉敏

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科(200072)

背景：免疫因素在炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。臨床研究顯示雷公藤多甙對(duì)IBD有良好療效。目的：探討雷公藤多甙對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠Th17/Treg細(xì)胞分化和平衡的影響。方法：建立TNBS-乙醇結(jié)腸炎大鼠模型，分別予0.9% NaCl溶液(模型組)、雷公藤多甙和美沙拉嗪灌胃干預(yù)，2周后行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)和結(jié)腸黏膜損傷評(píng)估。提取各組腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞，采用ELISA法檢測(cè)上清液中的Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平。采用免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠結(jié)腸炎癥狀較重，DAI評(píng)分以及黏膜損傷大體和組織學(xué)評(píng)分顯著高于雷公藤多甙組和美沙拉嗪組(P<0.05)，兩種藥物對(duì)結(jié)腸炎癥的改善作用無(wú)明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，美沙拉嗪組和雷公藤多甙組腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上清液中的IL-23、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，雷公藤多甙還可降低IL-6水平(P<0.05)。美沙拉嗪組TGF-β水平顯著高于雷公藤多甙組(P<0.05)；兩種藥物對(duì)IFN-γ水平均無(wú)影響(P>0.05)。美沙拉嗪可顯著下調(diào)結(jié)腸組織IL-6表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：抑制Th17細(xì)胞分化、促進(jìn)Treg細(xì)胞分化以調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡可能是雷公藤多甙對(duì)IBD的治療機(jī)制之一。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因未明、累及胃腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，一般指潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)。其發(fā)病機(jī)制迄今仍未闡明，目前認(rèn)為是由包括免疫、遺傳、環(huán)境、微生物等在內(nèi)的多種因素相互作用的結(jié)果，免疫因素在其中起重要作用。在IBD的免疫因素中，既往認(rèn)為由CD4+T細(xì)胞分化而來(lái)的Th1與Th2細(xì)胞失衡最為關(guān)鍵，近年研究表明Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg細(xì)胞)同樣起有重要作用。白細(xì)胞介素-17(IL-17)是Th17細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，其為促炎細(xì)胞因子，與包括自身免疫性疾病在內(nèi)的多種慢性炎癥性疾病有關(guān)[1]。Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，控制免疫應(yīng)答強(qiáng)度，誘導(dǎo)免疫耐受[2]。

雷公藤是重要的天然藥物資源，臨床應(yīng)用歷史悠久且廣泛。雷公藤多甙是中藥雷公藤的常用劑型，含有雷公藤中的多種有效藥理成分如雷公藤甲素(triptolide)。中醫(yī)理論認(rèn)為雷公藤具有祛風(fēng)除濕、舒經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛、殺蟲(chóng)解毒等功效，臨床上主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療。近年研究發(fā)現(xiàn)雷公藤中的有效成分還具有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤、抗生育、抗菌、止痛等活性[3]。多項(xiàng)涉及雷公藤或其藥用成分(雷公藤多甙或雷公藤甲素)治療IBD的臨床研究顯示療效確切[4-6]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞為切入點(diǎn)，通過(guò)建立大鼠結(jié)腸炎模型，觀察雷公藤多甙對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Th17/Treg細(xì)胞分化和平衡的影響，以期進(jìn)一步闡明該藥對(duì)IBD中Th17/Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康成年雄性Wistar大鼠18只，體質(zhì)量250～290 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。三硝基苯磺酸(TNBS; Sigma-Aldrich LLC.)；雷公藤多甙、美沙拉嗪(上海源葉生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(CUSABIO?，武漢華美生物工程有限公司)；抗IL-6、抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、抗干擾素-γ(IFN-γ)抗體(Abcam plc.)；抗IL-17抗體(國(guó)產(chǎn)試劑)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

二、方法

1.結(jié)腸炎模型建立：18只大鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1周后隨機(jī)抽取3只作為對(duì)照組，繼續(xù)標(biāo)準(zhǔn)飼料飲食；其余15只大鼠隨機(jī)分為三組：模型組、雷公藤多甙組和美沙拉嗪組，禁食24 h后予5%氯胺酮(0.2 mL/100 g)腹腔麻醉，將長(zhǎng)度約12 cm的聚丙烯導(dǎo)管插入肛門約8 cm，一次性注入含30 mg TNBS的50%乙醇溶液，使動(dòng)物平臥，自然清醒，標(biāo)準(zhǔn)飼料飲食。造模當(dāng)日起三組分別予0.9% NaCl溶液2 mL、50 mg/kg雷公藤多甙2 mL、40 mg/kg美沙拉嗪2 mL灌胃，每日1次，共2周。

2.一般情況評(píng)估：每天觀察大鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量變化、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食情況和糞便性狀，處死前行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)評(píng)分(分別對(duì)體質(zhì)量下降百分比、糞便黏稠度和便血情況進(jìn)行評(píng)分，總分為3項(xiàng)評(píng)分的均值)。

3.結(jié)腸黏膜損傷評(píng)估：2周后處死大鼠，無(wú)菌操作下取肛門至回盲部結(jié)腸，肉眼觀察并記錄病理變化后，冰0.9% NaCl溶液沖洗，4%甲醛溶液固定，以大頭針固定于板上并保持于0.9% NaCl溶液中，按以下標(biāo)準(zhǔn)行黏膜損傷大體評(píng)分。①粘連：無(wú)，0分；較輕(少許力量即可將結(jié)腸與其他組織分離)，1分；較重，2分。②腸壁厚度：<1.5 mm，0分；1.5～3.0 mm，1分；>3.0 mm，2分。③潰瘍：無(wú)損傷，0分；輕度充血水腫，表面光滑，無(wú)糜爛或潰瘍，1分；一個(gè)部位的潰瘍或炎癥，沿結(jié)腸長(zhǎng)軸方向(縱徑)<1 cm，2分；兩個(gè)或更多部位的潰瘍或炎癥，縱徑≤1 cm，3分；損傷較大，縱徑>1 cm，4分；損傷區(qū)域縱徑>2 cm，每增加1 cm加1分，5～10分。

取損傷最嚴(yán)重處結(jié)腸組織，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，切片脫蠟至水，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病變情況，按以下標(biāo)準(zhǔn)行黏膜損傷組織學(xué)評(píng)分。①炎癥：無(wú)炎癥，0分；輕度炎癥，1分；中度炎癥，2分；重度炎癥，3分。②浸潤(rùn)深度：無(wú)浸潤(rùn)，0分；浸潤(rùn)至黏膜下層，1分；浸潤(rùn)至黏膜下肌層，2分；浸潤(rùn)至漿膜層，3分。

4.細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)：提取腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)其上清液中的Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-17(IL-17A和IL-17F)、IL-22、IL-21、IL-23、TNF-α水平和Treg相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、IFN-γ水平。樣本和試劑盒取出后平衡30 min，按說(shuō)明書(shū)配置標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，每孔加入50 μL生物素結(jié)合物，室溫200 r/min孵育2 h，洗滌4次；每孔加入100 μL HRP標(biāo)記鏈霉親和素，室溫200 r/min孵育1 h，洗滌4次；每孔加入100 μL TMB底物溶液，避光室溫200 r/min孵育10 min；每孔加入100 μL終止液，讀取酶標(biāo)儀450 nm處吸光度值(A值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查得樣品中各細(xì)胞因子濃度。

5.免疫組化染色：取損傷最嚴(yán)重處結(jié)腸組織切片，脫蠟、水化，3% H2O2浸泡10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，水洗3 min×2次，枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復(fù)；加入1∶100稀釋的一抗，4 ℃冰箱中保存過(guò)夜；恢復(fù)至室溫后，PBS洗5 min×3次，加入二抗，37 ℃溫箱孵育0.5 h；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。陽(yáng)性染色為棕黃色至棕褐色，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)顯色，0分；棕黃色，1分；棕褐色，2分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)腸炎模型評(píng)估

結(jié)腸組織切片HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯異常，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)；模型組大鼠腸壁結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)；雷公藤多甙組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減少(圖1C)；美沙拉嗪組細(xì)胞形態(tài)大致正常，僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)。

四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，模型組大鼠體質(zhì)量下降明顯，便血程度較重，肉眼觀察結(jié)腸組織有多處黏膜炎癥、潰瘍，DAI評(píng)分、黏膜損傷大體和組織學(xué)評(píng)分均明顯高于雷公藤多甙組、美沙拉嗪組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雷公藤多甙組與美沙拉嗪組間DAI評(píng)分以及黏膜損傷大體和組織學(xué)評(píng)分無(wú)明顯差異(P>0.05；圖2)。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：雷公藤多甙組；D美沙拉嗪組

圖2 各組大鼠DAI評(píng)分以及結(jié)腸組織大體和組織學(xué)評(píng)分

二、腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上清液Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平

ELISA檢測(cè)顯示，美沙拉嗪組腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上清液TGF-β水平高于雷公藤多甙組，IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-23、TNF-α水平低于模型組，IL-22水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-6、IFN-γ水平與其余各組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。雷公藤多甙組IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22水平較美沙拉嗪組有所升高，IL-6、IL-23、TNF-α水平較模型組有所下降，IL-17F水平較對(duì)照組有所升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IFN-γ、TGF-β水平與其余各組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。模型組IL-17A、IL-17F、IL-23、TNF-α水平較對(duì)照組有所升高，IL-22水平較雷公藤多甙組、對(duì)照組有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖3)。

三、結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子表達(dá)

免疫組化染色顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-6表達(dá)高于美沙拉嗪組和對(duì)照組(P<0.05)，各組間IL-17、TNF-α、IFN-γ表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖4、圖5)。

圖3 各組大鼠腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上清液Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平

討 論

IBD患者的胃腸道炎癥黏膜中有大量Th17細(xì)胞浸潤(rùn)，且存在Th17相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-21、IL-23等)過(guò)度表達(dá)[1，7-8]。Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-23、TNF-α等在IBD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究顯示，可分化為Th17細(xì)胞的原始CD4+T細(xì)胞表達(dá)凝集素受體CD161[9]，同時(shí)表達(dá)多種細(xì)胞因子受體，如IL-6R、TGF-βR、IL-23R、IL-21R等。上述受體的存在表明相應(yīng)細(xì)胞因子參與了CD161+CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的過(guò)程。目前已明確，IL-6和適量的TGF-β共同啟動(dòng)Th17細(xì)胞分化，其他細(xì)胞因子如IL-23、IL-21則在Th17細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮作用[8]。IL-17A和IL-17F在Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[10]。IL-22是上皮細(xì)胞行使免疫屏障功能的基本細(xì)胞因子，具有抗炎和促炎的雙重作用，并參與損傷修復(fù)過(guò)程[11-12]。IL-21則主要表現(xiàn)為促炎作用[1]。

A：模型組；B：美沙拉嗪組；C：雷公藤多甙組；D：對(duì)照組

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子表達(dá)

CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞是一類具有維持機(jī)體免疫耐受功能的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β、可溶性纖維蛋白原樣蛋白2(sFGL2)等發(fā)揮免疫抑制作用[13]。TGF-β可調(diào)控Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)，從而誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化[14]。IBD的發(fā)生與Treg細(xì)胞減少和功能異常有密切聯(lián)系，由于缺乏Treg細(xì)胞的免疫抑制作用，效應(yīng)T細(xì)胞可引發(fā)腸道過(guò)度免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致腸黏膜損傷[13]。研究顯示，IBD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例顯著低于健康人，并與疾病復(fù)發(fā)相關(guān)[15]；予免疫缺陷小鼠注射不含CD4+CD25+Treg細(xì)胞的效應(yīng)T細(xì)胞可誘發(fā)嚴(yán)重自身免疫性結(jié)腸炎，給予CD4+CD25+Treg細(xì)胞則可誘導(dǎo)炎癥緩解[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷公藤多甙組和美沙拉嗪組結(jié)腸炎模型大鼠在結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)、結(jié)腸組織大體和組織學(xué)表現(xiàn)方面均無(wú)明顯差異，且均優(yōu)于模型組，表明雷公藤多甙可有效緩解實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，療效與美沙拉嗪相似。進(jìn)一步對(duì)各組大鼠腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上清液中的Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示雷公藤多甙與美沙拉嗪一樣，能降低結(jié)腸炎模型大鼠的IL-23、TNF-α水平；此外，雷公藤多甙還可降低IL-6水平。大量存在于腸黏膜固有層的IL-6和TGF-β激活STAT3信號(hào)通路，促使Th17細(xì)胞分化，而雷公藤多甙中的雷公藤甲素在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中均顯示出可抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路和IL-17基因表達(dá)[17]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雷公藤多甙可能通過(guò)抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路減少原始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，同時(shí)通過(guò)抑制IL-23抑制Th17細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示美沙拉嗪能抑制IL-17A和IL-17F分泌，從而緩解結(jié)腸炎癥，但未觀察到雷公藤多甙對(duì)這兩種促炎細(xì)胞因子發(fā)揮類似效應(yīng)，雷公藤多甙對(duì)IL-17的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)顯示，雷公藤多甙對(duì)結(jié)腸炎模型大鼠腸系膜淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞上清液中TGF-β的影響程度弱于美沙拉嗪。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可增強(qiáng)體外培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞表達(dá)Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，促進(jìn)原始T細(xì)胞向Foxp3+Treg細(xì)胞分化[18]。Treg細(xì)胞分泌的TGF-β主要參與誘導(dǎo)和維持Foxp3表達(dá)。同時(shí)，其還可與自身細(xì)胞膜受體結(jié)合，激活后再借助細(xì)胞-細(xì)胞間接觸發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。適量的TGF-β能抑制炎癥反應(yīng)，過(guò)度表達(dá)則參與促進(jìn)炎癥反應(yīng)。雷公藤多甙對(duì)T細(xì)胞亞群具有非選擇性和非平衡性的抑制作用，可糾正機(jī)體內(nèi)各T細(xì)胞亞群的病理性平衡[19]，故能在升高TGF-β表達(dá)的同時(shí)對(duì)其發(fā)揮一定抑制作用，在本實(shí)驗(yàn)中最終表現(xiàn)為抑制作用。

研究[20]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能降低結(jié)腸炎模型動(dòng)物的結(jié)腸組織IFN-γ水平。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressors of cytokine signaling, SOCS)是一組細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白家族，可被多種細(xì)胞因子如IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)可抑制JAK-STAT信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，形成負(fù)反饋環(huán)，從而在一定程度上抑制IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)控T細(xì)胞分化[21]。推測(cè)這可能是本實(shí)驗(yàn)中雷公藤多甙和美沙拉嗪均不能升高IFN-γ水平的原因之一。

本研究免疫組化分析顯示，美沙拉嗪可顯著降低結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中的IL-6表達(dá)，表明其可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)減輕腸道炎癥。雷公藤多甙在免疫組化分析中未表現(xiàn)出抑制結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子表達(dá)的作用，可能與取材、實(shí)驗(yàn)方法等多種因素有關(guān)。

綜上所述，本研究探討了雷公藤多甙對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，在重建Th17/Treg平衡中發(fā)揮一定作用。抑制Th17細(xì)胞分化、促進(jìn)Treg細(xì)胞分化以調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡可能是雷公藤多甙對(duì)IBD的治療機(jī)制之一，該發(fā)現(xiàn)為雷公藤多甙用于IBD的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。雷公藤多甙對(duì)IBD中Th17/Treg平衡的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。