高蘇萌 王卓婷 徐 磊 沈永華 凌亭生 王 雷 鄒曉平 陳 敏

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

背景：c-Myc和PKM2在多種腫瘤中高表達(dá)，但mTOR/PKM2和STAT3/c-Myc信號(hào)通路對(duì)胃癌調(diào)節(jié)作用的研究不多見(jiàn)。目的：探討mTOR/PKM2和STAT3/c-Myc信號(hào)通路串話調(diào)節(jié)胃癌能量代謝和酸性微環(huán)境的機(jī)制。方法：PKM2和c-Myc慢病毒轉(zhuǎn)染人胃癌AGS和HGC-27細(xì)胞，構(gòu)建敲減PKM2、c-Myc的細(xì)胞模型。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)PKM2、c-Myc、LDHA、STAT3、p-STAT3、GLUT-1 mRNA和蛋白表達(dá)，比色法檢測(cè)乳酸和葡萄糖水平。結(jié)果：PKM2和c-Myc表達(dá)在胃癌細(xì)胞中上調(diào)。敲減c-Myc可抑制胃癌細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞遷移能力明顯降低，LDHA、GLUT-1蛋白表達(dá)明顯降低，葡萄糖和乳酸含量明顯降低。共同敲減PKM2和c-Myc對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力和糖酵解代謝的抑制作用更明顯。mTOR/PKM2與STAT3/c-Myc信號(hào)通路之間存在相關(guān)性。結(jié)論：PKM2聯(lián)合c-Myc可能成為胃癌新的治療靶點(diǎn)。

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率分別位居第四位和第二位。惡性腫瘤細(xì)胞的代謝變化為其重要的標(biāo)志之一[2]。

Warburg效應(yīng)是指惡性腫瘤細(xì)胞在氧充足的情況下，激活有氧糖酵解，導(dǎo)致葡萄糖代謝成為乳酸，隨后被單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌至細(xì)胞外，產(chǎn)生并維持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的酸性微環(huán)境[3]。細(xì)胞外低pH值微環(huán)境亦可促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為，包括侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥、細(xì)胞增殖等[4]。

c-Myc是Myc基因家族的重要成員，在腫瘤能量代謝中發(fā)揮重要作用，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖酵解水平，從而促進(jìn)腫瘤的Warburg效應(yīng)[5-6]。丙酮酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，可將磷酸烯醇丙酮酸的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至ADP，從而生成丙酮酸和ATP分子。M2型丙酮酸激酶(PKM2)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[7]。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路及其下游靶基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡來(lái)提高癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物的耐受能力[8]。STAT3異常激活與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、多藥耐藥、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)相關(guān)特征密切相關(guān)[9]。c-Myc是STAT3下游調(diào)控的靶基因之一[10]。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體蛋白, HIF-1α?xí)龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解, 調(diào)控PKM2、GLUT-1、LDHA等基因表達(dá)，并使腫瘤細(xì)胞在低氧微環(huán)境下得以存活并使腫瘤的惡性程度進(jìn)一步增強(qiáng)。

本研究通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)來(lái)研究mTOR/PKM2和STAT3/c-Myc信號(hào)通路是否可調(diào)節(jié)胃癌能量代謝、能逆轉(zhuǎn)其酸性腫瘤微環(huán)境，旨在改善腫瘤惡性生物學(xué)行為，并探討兩種信號(hào)通路之間是否存在內(nèi)在的相互作用，闡明上游和下游分子之間的關(guān)系以便提供新的聯(lián)合治療靶點(diǎn)，從而為胃癌的治療提供一個(gè)新的思路。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

AGS、GES、HGC-27、MKN45、N-87細(xì)胞株均來(lái)源于南京鼓樓醫(yī)院消化病學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

抗人PKM2(cst3198)、LDHA(cst3582)、STAT3(cst4904)、c-Myc(cst3987s)、GLUT-1抗體、p-STAT3單克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology, Inc.?？谷甩?actin單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

BCA蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。TEMED有機(jī)溶劑、溴酚藍(lán)、結(jié)晶紫粉末購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit、實(shí)時(shí)PCR試劑盒 SYBR?Premix Ex TaqTMII購(gòu)于Takara公司。Transwell小室購(gòu)于BD公司。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Dojindo公司。乳酸、葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision公司。細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自BD Biosciences公司。蛋白質(zhì)印跡法的實(shí)驗(yàn)儀器均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。慢病毒懸液均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。雷帕霉素試劑購(gòu)自Cell Signaling Technology, Inc.。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將106/孔AGS和HGC-27細(xì)胞接種于6孔板，加入RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，替換為含有5 μg/mL 聚凝胺的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基，并加入慢病毒懸液，37 ℃孵箱中溫育24 h，更換為RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d。

2.CCK-8實(shí)驗(yàn)：取各組細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/mL，接種于96孔板，每孔為100 μL；對(duì)照組加入相同體積的PBS溶液；分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后，每孔加入100 μL含有10% CCK-8溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h；上酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

3.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：待各組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)時(shí)，胰酶消化，加入2 mL RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為6×104/mL。取出Transwell小室，在12孔板的下室中加入含15% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基750 μL，在上室中加入500 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h；PBS清洗，甲醇固定；0.5%的結(jié)晶紫液體染色15 min，PBS清洗；光學(xué)顯微鏡下觀察。

4.集落形成實(shí)驗(yàn)：以5 000/孔的細(xì)胞接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)5～7 d，以PBS溶液清洗，甲醇固定，0.5%的結(jié)晶紫溶液染色15 min，自然光下拍照。

5.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：取融合度為80%的各組細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS溶液重懸，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μL結(jié)合緩沖液和2.5 μL Annexin V-FITC，避光置于37 ℃ 孵箱20 min，再加入2.5 μL PI，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法：收集各組細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因和內(nèi)參β-actin基因的引物均由華大基因公司設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次；72 ℃終延伸7 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA表達(dá)水平。

7.蛋白質(zhì)印跡法：取各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。取15～20 μg蛋白行8% SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜，5%脫脂奶粉封閉120 min，4 ℃加入一抗(稀釋濃度為1∶1 000)封閉過(guò)夜，TBST洗滌5 min×3次；加入稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌；曝光，顯影，攝片。采用Image J圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，以各目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)情況。

8.葡萄糖、乳酸檢測(cè)：采用比色法檢測(cè)葡萄糖、乳酸水平，具體步驟按說(shuō)明書(shū)步驟操作。

9.雷帕霉素處理細(xì)胞：在胃癌AGS細(xì)胞中加入不同濃度(5、10、15 nmol/L)mTOR抑制劑雷帕霉素處理細(xì)胞。

10.siRNA 轉(zhuǎn)染: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AGS細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染空載體pU6質(zhì)粒(空載體組)和STAT3 siRNA干擾質(zhì)粒(STAT3 siRNA組)，以400 μg/mL G418培養(yǎng)液進(jìn)行高轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞株篩選2周，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、敲減c-Myc可抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力和糖酵解水平

PKM2和c-Myc在AGS和HGC-27細(xì)胞中表達(dá)升高(P<0.05;圖1A)。以c-Myc慢病毒處理AGS和HGC-27細(xì)胞后，c-Myc mRNA表達(dá)和蛋白均明顯減少(P<0.05;圖1B、1C)；細(xì)胞增殖能力明顯降低，且呈時(shí)間依賴性(P<0.05;圖1D)；細(xì)胞集落形成明顯下降(P<0.05;圖1E)；細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.05;圖1F)；LDHA、GLUT-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05;圖1G)；葡萄糖和乳酸含量明顯降低(P<0.05;圖1H)。

二、共同敲減PKM2和c-Myc可抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力和糖酵解水平

AGS和HGC-27細(xì)胞共同敲減PKM2和c-Myc表達(dá)后，PKM2、c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05;圖2A)；細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05;圖2B)；細(xì)胞集落形成明顯下降(P<0.05;圖2C)；細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.05;圖2D)；細(xì)胞凋亡明顯升高(P<0.05;圖2E)；LDHA、GLUT-1蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05;圖2F)；葡萄糖和乳酸水平明顯降低(P<0.05;圖2G)。共同敲減組對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力和糖酵解水平的抑制作用強(qiáng)于單獨(dú)敲減PKM2或c-Myc。

三、mTOR/PKM2和STAT3/c-Myc共同調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞糖代謝

以不同濃度(5、10、15 nmol/L)mTOR抑制劑雷帕霉素處理胃癌AGS細(xì)胞后，STAT3、c-Myc、PKM2蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，而LDHA、GLUT-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(圖3A)。以siRNA下調(diào)AGS細(xì)胞中STAT3表達(dá)后，c-Myc、LDHA蛋白表達(dá)受到明顯抑制(P<0.05)，而PKM2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(圖3B)。在AGS和HGC-27細(xì)胞中，單獨(dú)敲減PKM2后，c-Myc蛋白表達(dá)升高，STAT3蛋白表達(dá)下降；而單獨(dú)敲減c-Myc后，PKM2蛋白表達(dá)下降(圖3C、3D)。同時(shí)抑制STAT3后，PKM2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。而抑制PKM2后，STAT3蛋白表達(dá)下降，c-Myc蛋白表達(dá)升高，抑制c-Myc后，PKM2蛋白表達(dá)下降。通路中靶蛋白的mRNA表達(dá)變化與蛋白表達(dá)一致(圖3E-3G)。

表1 各基因的引物序列

A：PKM2和c-Myc在不同細(xì)胞中的表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；B：c-Myc mRNA表達(dá)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)；C：c-Myc蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；D：細(xì)胞增殖(CCK-8法)；E：集落形成；F：細(xì)胞遷移(Transwell小室法)；G：LDHA、GLUT-1蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；H：葡萄糖和乳酸含量(比色法)

圖1 敲減c-Myc可抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力和糖酵解水平

A：PKM2、c-Myc表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)；B：細(xì)胞增殖(CCK-8法)；C：集落形成；D：細(xì)胞遷移(Transwell小室法)；E：細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))；F：LDHA、GLUT-1蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；G：葡萄糖、乳酸含量(比色法)

圖2 共同敲減PKM2和c-Myc可抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力和糖酵解水平

A-D：不同處理后的蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；E-H：不同處理后的mRNA表達(dá)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)

討 論

腫瘤作為一個(gè)相互作用的細(xì)胞群體，通過(guò)構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)控其能量代謝[11]。因此，通過(guò)對(duì)胃癌能量代謝通路的干預(yù)來(lái)改善其惡性生物學(xué)行為，是現(xiàn)今胃癌的主要研究方向之一。

PKM2和c-Myc作為兩種重要靶基因在不同類型腫瘤中起有重要作用，在肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌中高表達(dá)[12-15]。有文獻(xiàn)證實(shí)PKM2、HIF-1α和STAT3存在交互作用[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)PKM2和c-Myc在胃癌AGS和HGC-27細(xì)胞中高表達(dá)。

mTOR/PKM2信號(hào)通路可調(diào)控胃癌糖酵解，且與腫瘤酸性微環(huán)境密切相關(guān)。前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，使用siRNA抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中PKM2 mRNA和蛋白表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的增殖能力和糖酵解水平均受到明顯抑制。本研究發(fā)現(xiàn)以不同濃度(5、10、15 nmol/L)mTOR抑制劑雷帕霉素處理胃癌AGS細(xì)胞后，STAT3、c-Myc、PKM2蛋白表達(dá)均明顯降低；應(yīng)用siRNA技術(shù)特異性下調(diào)胃癌AGS細(xì)胞中STAT3表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，下游c-Myc表達(dá)明顯下調(diào)。因此，推測(cè)mTOR/PKM2與STAT3/c-Myc信號(hào)通路共同構(gòu)成了調(diào)控胃癌能量代謝的分子網(wǎng)絡(luò)，兩條信號(hào)通路之間可能存在相互作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，敲減c-Myc可抑制胃癌細(xì)胞增殖能力、遷移能力和集落形成能力，并抑制糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)以及胞外葡萄糖和乳酸水平，從而抑制胃癌細(xì)胞的糖酵解。共同敲減PKM2和c-Myc可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且該作用較單獨(dú)敲減PKM2或c-Myc更明顯。說(shuō)明PKM2和c-Myc的共同抑制可能是胃癌治療的新靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，激活mTOR信號(hào)通路后，多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，提高細(xì)胞增殖能力[19]。雷帕霉素表達(dá)在胃癌的原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移灶中均較高，且p-mTOR過(guò)表達(dá)可作為原發(fā)性胃癌根治術(shù)后預(yù)后良好的獨(dú)立因素。此外，惡性腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與p-mTOR表達(dá)及其在細(xì)胞內(nèi)的定位相關(guān)。有研究顯示，STAT3調(diào)控的許多下游靶基因與細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程密切相關(guān)，如Bcl-2、c-Myc、Fas等[20]。STAT3持續(xù)激活與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度有關(guān)，且能在裸鼠實(shí)驗(yàn)中形成腫瘤，故目前普遍認(rèn)為STAT3為一種癌基因[21-22]。

本研究以不同濃度mTOR抑制劑雷帕霉素拮抗處理AGS細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，隨著mTOR蛋白表達(dá)下降，PKM2表達(dá)隨之下降。說(shuō)明mTOR位于PKM2的上游，并可調(diào)控PKM2表達(dá)，這種調(diào)節(jié)作用可能與mTOR濃度相關(guān)，其機(jī)制仍需行進(jìn)一步研究。抑制mTOR后，STAT3蛋白表達(dá)亦明顯降低。以siRNA干擾STAT3表達(dá)后，AGS細(xì)胞中c-Myc蛋白表達(dá)亦明顯下降，而其他靶基因蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。故推測(cè)在mTOR信號(hào)通路中，mTOR位于STAT3的上游，STAT3位于c-Myc的上游，上游基因可調(diào)控下游基因的表達(dá)。

目前肝細(xì)胞癌中STAT3與c-Myc關(guān)系的研究較為多見(jiàn)，STAT3可能通過(guò)上調(diào)c-Myc來(lái)抑制肝癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[23-24]。本研究在AGS和HGC-27細(xì)胞中敲減PKM2，結(jié)果顯示c-Myc蛋白表達(dá)增加，STAT3蛋白表達(dá)降低。由于PKM2蛋白表達(dá)在抑制STAT3表達(dá)后無(wú)明顯變，推測(cè)PKM2可能位于STAT3的上游，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。敲減c-Myc后，PKM2蛋白表達(dá)降低。因此，PKM2和c-Myc可能存在更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過(guò)更多的基因分子間彼此互相調(diào)控，從而影響彼此上、下游基因的表達(dá)，未來(lái)需行進(jìn)一步的假設(shè)和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究存在一定的局限之處。首先，上述體外實(shí)驗(yàn)并未行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果。其次，本實(shí)驗(yàn)探討了PKM2與STAT3的上、下游關(guān)系，PKM2與c-Myc之間存在相互關(guān)系，mTOR對(duì)PKM2的調(diào)節(jié)關(guān)系，但PKM2調(diào)控STAT3的具體機(jī)制，PKM2與c-Myc兩條信號(hào)通路之間相互作用的具體機(jī)制以及mTOR對(duì)PKM2的調(diào)節(jié)作用及其與濃度的關(guān)系均尚未完全闡明。

總之，本研究證實(shí)共同敲減PKM2和c-Myc對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力和糖酵解代謝的抑制作用較單獨(dú)敲減更為明顯。mTOR/PKM2和STAT3/c-Myc信號(hào)通路之間存在相關(guān)性。PKM2聯(lián)合c-Myc可能成為胃癌新的治療靶點(diǎn)。但上述研究結(jié)論仍需行進(jìn)一步研究證實(shí)。