潘正波，張海濤，蔡海榮，胡恩平，劉 晟

0 引言

前列腺癌是泌尿生殖系中常見的腫瘤，近年來，亞洲前列腺癌的發(fā)病率及死亡率逐年升高[1]。目前，根據(jù)前列腺癌的分期，前列腺癌的治療主要包括根治性切除術(shù)、內(nèi)分泌治療、放化療等[2]。石榴皮為石榴科石榴屬植物石榴(PunicagranatumL)的干燥果皮，鞣質(zhì)為石榴皮的主要活性成分。研究表明，鞣質(zhì)類成分具有較好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性[3-4]。

本研究以前列腺癌PC-3細胞為研究對象，研究石榴皮鞣質(zhì)對前列腺癌PC-3細胞侵襲性的影響及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

1.1.1 PC-3細胞復(fù)蘇 細胞株：人前列腺癌PC-3細胞，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。從液氮罐中取出細胞復(fù)蘇時應(yīng)注意避免損傷細胞。

1.1.2 PC-3細胞培養(yǎng) 傳代收集及計數(shù):將細胞培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下,觀察細胞消化并進行計數(shù)，計數(shù)細胞懸液的密度。細胞密度計數(shù)=(4個大格細胞總數(shù)/4)×104個/ml。

1.2 實驗分組及石榴皮鞣質(zhì)處理 將正常條件下培養(yǎng)細胞的PC-3分為4組，第1組為未加石榴皮鞣質(zhì)的空白對照組(對照組)，第2組加石榴皮鞣質(zhì)25 μg/ml，第3組加石榴皮鞣質(zhì)50 μg/ml，第4組加石榴皮鞣質(zhì)100 μg/ml。

1.3 劃痕愈合實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞運動性的影響 將6×105個處于對數(shù)生長期的細胞均勻平鋪到無菌6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。當細胞覆蓋率達到90%時進行劃痕愈合實驗。用10 μl Tip頭在培養(yǎng)皿中輕輕地快速劃兩條平行直線，注意不要用力過大以免劃傷底部，然后用磷酸鹽緩沖液清洗細胞3次，將6孔培養(yǎng)板放于倒置顯微鏡下觀察并拍照，24 h再次觀察并拍照。根據(jù)各組細胞劃痕的愈合率來進行統(tǒng)計分析。

1.4 Transwell小室實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞運動性的影響 ①在沒有基質(zhì)膠Transwell板下室中加入500 μl的TEME高糖完全培養(yǎng)基，并把Transwell小室放于其中。再把培養(yǎng)板放于細胞培養(yǎng)箱中水化15 min。②在Transwell小室中加入1×105個處于對數(shù)生長期的細胞并在上室中添加200 μl不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，再把Transwell板放在細胞培養(yǎng)箱中放置24 h。③24 h后用棉團把Transwell上室內(nèi)部的細胞和培養(yǎng)基完全輕輕擦掉，然后放在預(yù)先冷凍過的多聚甲醛中浸沒15 min。④將Transwell小室倒扣在桌面，并在小室滴1滴結(jié)晶紫溶液，染色10 min。⑤10 min后用無菌PBS溶液洗掉結(jié)晶紫溶液，倒置Transwell小室于桌面上干燥，再放在倒置顯微鏡下觀察。⑥在10×顯微鏡下觀察各組穿過的細胞數(shù)目，并進行統(tǒng)計分析。

1.5 Transwell小室侵襲實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞侵襲能力的影響 ①在有基質(zhì)膠的Transwell板下室中加入500 μl的TEME高糖完全培養(yǎng)基，并把Transwell小室放于其中；再把培養(yǎng)板放于細胞培養(yǎng)箱中水化15 min。②在Transwell小室中加入1×105個處于對數(shù)生長期的細胞，并在上室中添加200 μl不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，再把Transwell板放在細胞培養(yǎng)箱中放置24 h。③24 h后用棉團把Transwell上室內(nèi)部的細胞和培養(yǎng)基完全輕輕擦掉，然后放在預(yù)先冷凍過的多聚甲醛中浸沒15 min。④將Transwell小室倒扣在桌面并在小室滴1滴結(jié)晶紫溶液，染色10 min。⑤10 min后用無菌PBS溶液洗掉結(jié)晶紫溶液，倒置Transwell小室于桌面上干燥，再放在倒置顯微鏡下觀察。⑥在10×顯微鏡下統(tǒng)計各組穿過的細胞數(shù)目，并進行統(tǒng)計分析。

1.6 肺轉(zhuǎn)移模型實驗檢測石榴鞣質(zhì)對PC-3細胞侵襲能力的影響

1.6.1 體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型實驗 全部實驗動物均購自上海景達小動物有限公司?；铙w實驗中，每組均有6只小鼠(6～8周齡的雄性BALB/C裸鼠)。收集培養(yǎng)瓶中狀態(tài)良好且處于對數(shù)期生長的各組癌細胞，將前列腺癌細胞濃度調(diào)整至5×107/ml，用1 ml注射器，加等量無菌水至總?cè)芤毫繛榭傋⑸淞康?/2，通過裸鼠尾靜脈注射制劑，每只裸鼠每日注射200 μl，并且相應(yīng)的腹腔注射對照組1 ml水，石榴皮鞣質(zhì)濃度分別為25、50、100 μg/ml時各1 ml。每只裸鼠每周注射2次。4周后將BALB/C免疫缺陷鼠用頸椎脫位法處死之前注入熒光素溶液(2.5 mg/25 g)。完整取出BALB/C-免疫缺陷鼠的肺臟，將BALB/C免疫缺陷鼠肺臟進行包埋切片。HE染色后顯微鏡下觀察肺臟內(nèi)的腫瘤有無轉(zhuǎn)移灶并計數(shù)。

1.6.2 HE染色 經(jīng)過石蠟包埋處理保存的組織樣本進行包埋切片。將水化的切片置于檸檬酸抗原修復(fù)液及微波爐微波修復(fù)。隨后蘇木素染核。將切片浸入1%鹽酸酒精中1～2 s，自來水中沖洗直至細胞核為亮藍色為止。將切片再次依次浸泡于50%乙醇5 min、75%乙醇5 min、90%乙醇5 min、無水乙醇5 min、二甲苯5 min脫水，使用中性樹脂(中杉金橋)和蓋玻片封片。選擇合適倍率的放大倍數(shù)觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 劃痕愈合試驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞運動能力的影響 劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，48 h之后對照組細胞的劃痕愈合速度較快，其愈合能力明顯強于石榴皮鞣質(zhì)處理的細胞，其48 h愈合率分別為84.76%、61.45%、35.87%、24.56%(P<0.05)。結(jié)果表明，石榴皮鞣質(zhì)對前列腺癌細胞運動具有抑制作用。見圖1。

圖1 劃痕愈合試驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞運動能力的影響

注：A.劃痕愈合試驗檢測對照組和石榴皮鞣質(zhì)組細胞的遷移能力，B.劃痕愈合試驗檢測的統(tǒng)計直方圖。與對照組比較，*P<0.05

2.2 Transwell實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞運動性的影響 不同濃度石榴皮鞣質(zhì)作用于PC-3細胞48 h后，結(jié)果顯示，在石榴皮鞣質(zhì)濃度分別為25、50、100 μg/ml時，PC-3細胞的穿膜細胞數(shù)分別為322.00±5.57、187.67±3.51、160.67±5.69，與對照組相比，EGCG作用48 h后能明顯降低PC-3細胞的趨化運動性(P<0.05)，且隨著石榴皮鞣質(zhì)濃度的逐漸增加，其抑制PC-3細胞趨化運動性也逐漸增強。見圖2。

2.3 Transwell小室侵襲實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞侵襲能力的影響 同濃度石榴皮鞣質(zhì)作用于PC-3細胞48 h后，結(jié)果顯示，在石榴皮鞣質(zhì)濃度分別為25、50、100 μg/ml時，PC-3細胞的穿膜細胞數(shù)分別為130.00±5.57、81.67±3.51、68.67±5.69，與對照組相比，石榴皮鞣質(zhì)作用48 h后能明顯降低PC-3細胞的侵襲性(P<0.05)，且隨著石榴皮鞣質(zhì)濃度的逐漸增加，其抑制PC-3細胞侵襲性也逐漸增強。見圖2。

圖2 Transwell實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞運動能力的影響

注：A.Transwell實驗檢測對照組與石榴皮鞣質(zhì)濃度分別為25、50、100 μg/ml時PC-3細胞穿膜細胞數(shù)的代表圖，B.Transwell實驗遷移實驗的統(tǒng)計直方圖。與對照組比較，*P<0.05

2.4 肺轉(zhuǎn)移模型實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞侵襲能力的影響 裸鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤模型試驗結(jié)果顯示，將BALB/C免疫缺陷鼠肺臟用石蠟包埋處理后，切片HE染色后顯微鏡下觀察肺臟內(nèi)的腫瘤有無轉(zhuǎn)移灶并計數(shù)，結(jié)果顯示，對照組細胞所形成的肺轉(zhuǎn)移裸鼠明顯多于石榴皮鞣質(zhì)濃度分別為0、25、50、100 μg/ml時PC-3細胞組的肺轉(zhuǎn)移裸鼠，肺轉(zhuǎn)移率分別為 100%(6/6)、50%(3/6)、33.33%(2/6)、16.67%(1/6)(P<0.05)。見圖4。

3 討論

圖3 Transwell實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞侵襲能力的影響

注：A.Transwell實驗檢測對照組與石榴皮鞣質(zhì)濃度分別為25、50、100 μg/ml時PC-3細胞穿膜細胞數(shù)的代表圖，B.Transwell實驗遷移實驗的統(tǒng)計直方圖。與對照組比較，*P<0.05

圖4 肺轉(zhuǎn)移模型實驗檢測石榴皮鞣質(zhì)對PC-3細胞侵襲能力的影響

注：A.HE染色顯示對照組細胞與石榴皮鞣質(zhì)濃度分別為25、50、100 μg/ml時PC-3細胞各組裸鼠肺轉(zhuǎn)移的典型染色圖片(100×)，B.各組裸鼠肺轉(zhuǎn)移數(shù)量統(tǒng)計柱狀圖

前列腺癌是較常見的發(fā)生在老年男性患者的惡性腫瘤，在美國占40歲以上男性癌癥死亡原因的第2位[5]，在我國部分城市前列腺癌的發(fā)病率正在逐年增長[6]。前列腺癌臨床分期不同其治療也有差異，根治性前列腺癌切除術(shù)因其療效確切，是治療早期前列腺癌的金標準[7]，但臨床上大部分前列腺癌患者就診時已錯過手術(shù)時機。

石榴皮中的主要活性成分石榴皮鞣質(zhì)，具有抗皮膚癌[8]、乳腺癌[9]作用。本文選用的PC-3細胞株屬于激素非依賴性前列腺癌細胞，具有高侵襲性，惡性程度高。石榴皮鞣質(zhì)是從石榴皮中提取的一類有效活性物質(zhì)，本研究應(yīng)用不同濃度石榴皮鞣質(zhì)作用于PC-3細胞，觀察其對腫瘤細胞侵襲性的影響。

劃痕愈合實驗檢測結(jié)果顯示，石榴皮鞣質(zhì)對前列腺癌細胞運動具有抑制作用。Transwell小室實驗(無基質(zhì)膠)檢測實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，石榴皮鞣質(zhì)作用48 h后能明顯降低PC-3細胞的趨化運動性，且隨著石榴皮鞣質(zhì)濃度的逐漸增加，其抑制PC-3細胞趨化運動性也逐漸增強。Transwell小室實驗(有基質(zhì)膠)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，石榴皮鞣質(zhì)作用48 h后，能明顯降低PC-3細胞的侵襲性，且隨著石榴皮鞣質(zhì)濃度的逐漸增加，其抑制PC-3細胞侵襲性也逐漸增強。

此外，本研究中BALB/C免疫缺陷鼠肺臟用HE染色后，在顯微鏡下觀察肺臟內(nèi)的腫瘤有無轉(zhuǎn)移灶并計數(shù)，結(jié)果顯示，對照組細胞形成的肺轉(zhuǎn)移裸鼠明顯多于石榴皮鞣質(zhì)PC-3細胞組的肺轉(zhuǎn)移裸鼠，與對照組相比，隨著石榴皮鞣質(zhì)濃度增加，PC-3細胞所形成的肺轉(zhuǎn)移瘤也逐漸減少。

綜上，本研究結(jié)果表明，石榴皮鞣質(zhì)可以有效抑制PC-3細胞的侵襲性，為開發(fā)與研究能夠抑制激素非依賴性前列腺癌侵襲性的藥物提供了理論依據(jù)。