張 艷,馬 莉,楊 爽,潘廣雯,樊 榕

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是神經(jīng)內(nèi)科臨床常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行性發(fā)展的退行性疾病，病理特征為大腦海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)元數(shù)目減少、神經(jīng)纖維纏結(jié)、海馬錐體細胞顆粒空泡變性、β淀粉樣蛋白沉積等，臨床癥狀表現(xiàn)為記憶障礙、行為障礙、認知功能下降等，病變可累及運動、神經(jīng)、泌尿等多個系統(tǒng)，導(dǎo)致患者逐漸喪失自理能力，嚴重影響其身心健康和生活質(zhì)量[1-2]。AD的病因及發(fā)病機制尚未明確，認為可能與老齡、頭部外傷史、雌激素缺乏、代謝、環(huán)境、遺傳等有關(guān)。治療以藥物治療、行為矯正為主，常用的藥物包括膽堿能藥物、抗氧化劑、腦細胞代謝激活劑等[3]。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)能夠產(chǎn)生多種細胞因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子等，具有神經(jīng)營養(yǎng)的作用，但BMSCs在體內(nèi)分化率、存活率較低；人參皂苷是中藥人參中的活性成分，具有興奮中樞神經(jīng)、促進DNA及RNA合成、改善記憶與學(xué)習(xí)能力的作用，在體外環(huán)境下人參皂苷對BMSCs具有誘導(dǎo)分化的作用[4]。鑒于此，本研究旨在探討人參皂苷聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠AD模型學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)元再生的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料 實驗動物：健康3月齡雄性SD大鼠45只(動物質(zhì)量合格證號：SCXK2019-0003)，體重250～300 g，平均體重(274.75±18.72)g，均購自北京維通利華實驗動物研究中心，SD大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進食進水，通風良好、自然光照。主要儀器：山東博科QP80C02培養(yǎng)箱、LD400臺式低速離心機、三目ZLD200-37T倒置相差顯微鏡、中西ZXKJ-HZ66-ZH動物腦立體定位儀、迷宮箱。主要試劑和藥品：DAB底物顯色試劑盒、SP即用型試劑盒、DMEM培養(yǎng)液(上海研生實業(yè)有限公司)、BI胎牛血清(上海唯問生物技術(shù)有限公司)、Percoll細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)、胰蛋白酶(蘇州甫路生物科技有限公司)、β淀粉樣肽25～35(Aβ25～35，上海莼試生物技術(shù)有限公司)、1%伊紅、0.5%蘇木精。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備45只SD大鼠AD模型 將Aβ25～35按照2 g/L溶于無菌生理鹽水中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育7 d以上，使其變成聚集狀態(tài)；按照0.3 g/kg腹腔注射水合氯醛(10%)使大鼠麻醉，將大鼠固定在立體定位儀上并明確大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)，用牙科鉆在前囟向后3 mm、中線旁開2.2 mm處鉆開顱骨，使用微量進樣器從腦表面垂直進針2.8 mm，緩慢注入Aβ25～35，速度控制在1 μl/min，需留針10 min以使Aβ25～35溶液充分彌散，緩慢撤針并縫合切口。

1.2.2 分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞 使用脫臼法處死6周齡SD大鼠，置于75%酒精中浸泡消毒，于無菌操作室取下大鼠股骨，使用DMEM培養(yǎng)液反復(fù)多次沖洗股骨髓腔，然后利用尼龍網(wǎng)過濾細胞，加入等體積的Percoll細胞分離液，離心20 min(2 000 r/min)后收集細胞，再使用DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗2次，然后按照每瓶5×106將細胞接種在培養(yǎng)瓶中(含有DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清)并進行純化、擴增、傳代，使用Brdu標記法標記傳3代后的細胞，然后備用。

1.2.3 動物分組 將45只AD模型大鼠隨機分為3組，各15只，A組大鼠采用骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療。將麻醉后的大鼠固定在立體定位儀上并明確雙側(cè)海馬區(qū)，將1 ml標記過并調(diào)整好濃度的骨髓間充質(zhì)干細胞懸液置于離心管，使用高壓消毒過的微量進樣器吸取干細胞懸液并于每個移植點注射5 μl，注射速度控制在0.5 μl/min，留針10 min，縫合皮膚。B組大鼠在A組基礎(chǔ)上予以腹腔注射人參皂苷Rg1，5 mg/kg，1次/d，持續(xù)治療1個月。C組大鼠單純腹腔注射5 μl生理鹽水，持續(xù)治療1個月。45只大鼠分開飼養(yǎng)1個月。

1.3 評價指標

1.3.1 三組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 分別于術(shù)后(干細胞移植前)、術(shù)后4周(干細胞移植后)采用Morris水迷宮進行定位航行試驗，測定并比較三組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。首先將實驗室溫度調(diào)整到24～25 ℃，在水迷宮中放入1 kg奶粉并用熱水沖開，加水直至水面超過安全平臺1 cm且水中不能明顯看到安全平臺，將水溫控制在26 ℃左右，整個實驗期間迷宮外設(shè)置足夠多的參照物如門、窗、燈等，參照物需始終保持位置不變以供大鼠定位平臺，將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠找到并爬上平臺所需的時間(逃避潛伏期)；如果大鼠在1 min內(nèi)沒有找到平臺，由實驗者將大鼠引向平臺，每天訓(xùn)練4次，上午2次，下午2次，每次間隔3 min，共訓(xùn)練4 d，大鼠找到并爬上平臺的時間(逃避潛伏期)即代表大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，統(tǒng)計并計算大鼠平均逃避潛伏期成績。

1.3.2 比較三組大鼠神經(jīng)元再生情況 飼養(yǎng)1個月后，麻醉大鼠并取下其雙側(cè)海馬，取材海馬組織樣本進行HE染色、免疫組化染色。

①HE染色：將取材樣本置于中性福爾馬林溶液(10%)中進行固定24 h，固定后使用流水沖洗取材樣本24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片使用二甲苯脫蠟：將組織切片置入二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min，更換50%的二甲苯再浸泡5 min，然后水化。水化：無水乙醇浸泡5 min，更換無水乙醇浸泡5 min，更換95%乙醇浸泡5 min，更換90%乙醇浸泡5 min，更換89%乙醇浸泡5 min，更換70%乙醇浸泡5 min，蒸餾水洗2 min。使用伊紅染色5 min，蒸餾水洗，然后脫水。脫水：依次使用70%、85%、95%、100%、100%的乙醇進行脫水，每步脫水時間為1 min。透明封片操作后在顯微鏡下觀察。

②免疫組化染色：將取材樣本置于多聚甲醛(4%)中進行固定24 h，固定后使用流水沖洗取材樣本24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片脫蠟及水化(步驟同上)后，使用0.1 M pH 7.4磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，5 min/次。向切片中加入過氧化物酶阻斷溶液50 μl，室溫孵育5 min后用PBS沖洗3次，5 min/次。將切片放入0.01 M pH 6.0抗原修復(fù)液(PBS稀釋過)容器中，然后將其置于爐上加熱直至溫度達到92～98 ℃，保持12 min，關(guān)火并從爐上取下，待溫度冷卻到70 ℃后，用PBS沖洗3次，5 min/次。向切片中加入非免疫性動物血清50 μl，室溫孵育10 min。除去多余血清后向切片中滴加適量一抗，37 ℃孵育1 h后，用PBS沖洗3次，5 min/次。向切片中加入生物素標記二抗50 μl，37 ℃孵育30 min后，用PBS沖洗3次，5 min/次。向切片中加入辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素溶液50 μl，37 ℃孵育15 min后，用PBS沖洗3次，5 min/次。向切片中加入DAB溶液100 μl后在顯微鏡下觀察，控制反應(yīng)時間并充分水洗切片以終止顯色。然后蘇木精染核-酒精脫水-二甲苯透明-中性樹膠封片，所有切片標本均在同一顯微鏡下的同一放大倍數(shù)、同一光強度下進行觀察，每張切片選取3個200×視野，細胞核呈棕黃色的即為BrdU陽性細胞，計數(shù)陽性細胞并以單個標本為單位計算平均值。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力 C組移植前、后的逃避潛伏成績相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；三組移植前逃避潛伏成績相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；移植后，A組和B組的逃避潛伏成績較移植前降低，A組、B組逃避潛伏成績均低于C組且B組低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 神經(jīng)元再生情況 A組和B組大鼠標本免疫組化染色后在顯微鏡下觀察到存在BrdU陽性細胞，B組BrdU陽性細胞數(shù)多于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.26,P<0.05)[1]。見表2。

表1 三組大鼠逃避潛伏期成績比較(s)

注：與C組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05

表2 A、B兩組大鼠BrdU陽性細胞數(shù)比較(個)

3 討論

隨著人口老齡化的日益加劇，我國AD發(fā)病率逐年上升，多數(shù)AD患者在確診后能生存8～10年[5]。AD的病因及病理機制雖不明確但存在多種學(xué)說，如Aβ學(xué)說、基因?qū)W說、膽堿能學(xué)說等。目前認為大腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)細胞的退變是造成AD的重要病理因素之一，正常情況下中樞膽堿能神經(jīng)可以合成大量的乙酰膽堿(ACh)，ACh經(jīng)投射纖維輸送到海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)，海馬區(qū)是學(xué)習(xí)記憶能力的重要解剖基礎(chǔ)，中樞膽堿能神經(jīng)傳遞則是學(xué)習(xí)記憶能力的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，AD患者中樞膽堿能神經(jīng)元退變，進而引起ACh的合成、釋放減少，導(dǎo)致記憶功能障礙、認知功能障礙等[6-8]。

本研究將BMSCs移植到大鼠雙側(cè)海馬區(qū)，HE染色顯示，A組大鼠切片表現(xiàn)為海馬錐體細胞部分脫失、排列較為均勻，結(jié)構(gòu)尚清晰，形態(tài)大致正常；B組大鼠切片表現(xiàn)為海馬錐體細胞排列較為整齊均勻，結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)基本正常；C組大鼠切片表現(xiàn)為海馬錐體細胞脫失，排列不規(guī)則，部分細胞體積縮小、細胞核固縮、細胞漿濃縮深染；且水迷宮定位航行試驗證實A組和B組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力優(yōu)于C組，且B組優(yōu)于A組，提示聯(lián)合治療效果確切，神經(jīng)元再生明顯，學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，分析其原因，BMSCs是具有多向分化潛能及自我更新能力的成體干細胞，具有遺傳背景穩(wěn)定、來源廣泛、分離培養(yǎng)容易、增殖能力強的特點[9-10]。骨髓來源的BMSCs不需要特異的分離方法就能達到分離純化的目的，對細胞的損傷小，在體外適宜的條件下BMSCs可分化為神經(jīng)細胞，將BMSCs移植到大鼠神經(jīng)損傷微環(huán)境中，BMSCs存活并分化為神經(jīng)組織組成細胞，替代病變的細胞，進而促進神經(jīng)組織的再生修復(fù)；此外，BMSCs可以與宿主細胞融合，進而改變宿主細胞表型，有利于改善神經(jīng)功能[11-12]。

中藥人參具有大補元氣、安神益智、復(fù)脈固脫、滋補強壯的功效。人參活性成分為人參皂苷。人參皂苷Rg1是人參皂苷中的一種，屬于三醇類，可促進囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運蛋白、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達，進而促使ACh合成、釋放增加[13]，起到抵抗AD進展、改善AD癥狀的作用[14]。人參皂苷Rg1可減少神經(jīng)元凋亡，促進海馬神經(jīng)再生，提高神經(jīng)可塑性，進而起到提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用[15]。人參皂苷Rg1還可通過干擾Aβ的生成和沉積、抑制tau蛋白過度磷酸化來減少Aβ聚集，進而減輕Aβ聚集對神經(jīng)元的損害[16]。此外，人參皂苷Rg1還具有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、抗炎癥反應(yīng)的作用[17]。

綜上所述，阿爾茨海默病模型大鼠采用人參皂苷聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植效果確切，可有效促進神經(jīng)元再生，提高學(xué)習(xí)記憶能力。