顏春魯 李盛華 安方玉* 孫仕華 劉永琦,2 藺興遙,2 張艷霞 楊譯 馬正民 牛彥強(qiáng)

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 4. 蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見于中老年人群的慢性關(guān)節(jié)退行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨的退變?yōu)橹饕±硖卣鱗1-2]。在OA的發(fā)病中，以膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)最為常見。KOA是一種以膝骨關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生為特征的慢性關(guān)節(jié)炎疾病[3]。近年來人們對(duì) KOA的防治逐漸聚焦于關(guān)節(jié)軟骨。有研究證實(shí)，減少基質(zhì)金屬蛋白酶和一些炎癥因子的分泌可以抑制KOA的炎癥反應(yīng)，從而緩解關(guān)節(jié)軟骨的退變[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR具有調(diào)控KOA關(guān)節(jié)軟骨退變的作用[5]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3在正常軟骨中穩(wěn)定表達(dá)，而在退變的軟骨(OA)中 Beclin1、LC3的表達(dá)是降低的[6]。因此，mTOR和Beclin1可能成為OA 治療的新靶點(diǎn)，通過抑制mTOR的表達(dá)和增強(qiáng)Beclin1 的表達(dá)，有可能保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的完整性和延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，進(jìn)而探索出一種防治骨關(guān)節(jié)炎的新療法。我們采用改良Hulth法制備KOA模型大鼠，通過觀察右歸丸對(duì)KOA模型大鼠炎癥細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein Kinase B，Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路的相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討右歸丸防治KOA的分子機(jī)理，為右歸丸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物：選取SPF級(jí)4～6月齡SD大鼠60只，雌雄各半，體重(180±20)g，購自我?？蒲袑?shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。

1.1.2試劑與藥物：水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20150105)；反轉(zhuǎn)錄試劑2×prime script RT master mix(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)： AI20 775 A)； 熒光定量SYBR P Remix EX TaqⅡ(美國(guó)Promega公司，批號(hào)為：0000304040)；GAPDH抗體(Immuno Way，批號(hào)：B4501)； Rabit Anti-PI3K Polyclonal Antibody(Abcam，批號(hào)：GR3192684-3)；Rabit Anti-pAkt Polyclonal Antibody(Gene Tex，批號(hào)：821801334)；Rabit Anti-pmTOR Polyclonal Antibody(Immuno Way，批號(hào)：B1107)；Rabit Anti-Beclin1 Polyclonal Antibody(Gene Tex，批號(hào)：821801315)；右歸丸(仲景宛西制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z41022170，批號(hào)：151108)；硫酸氨基葡萄糖片(保節(jié)力，新興同仁藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041317，批號(hào)：160302)；青霉素(河北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H13020657，批號(hào)：F6042103)。

1.1.3儀器：BioMATE 3S型蛋白、核酸濃度測(cè)定儀(Thermo公司)；ChemiDocTMXRS+

型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；BX53型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；ZY12306型微量加樣器(ScienTiFic產(chǎn)品)；C1000型PCR熱循環(huán)儀(美國(guó)ABI公司)；LightCycler 96型 Real Time PCR System(美國(guó)羅氏公司)；TGL16 M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(凱達(dá)集團(tuán)成員高科技公司)；OSE-Y10型電動(dòng)組織研磨器(上海Tiangen 公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥物的給藥劑量：右歸丸的臨床用量為27 g/d，以人與大鼠的體表面積換算法所得的右歸丸劑量(27 g×0.018×5≈2.4 g/kg)作為實(shí)驗(yàn)的中劑量。則右歸丸高、中、低劑量分別為4.8、2.4、1.2 g/kg。

1.2.2動(dòng)物分組、造模及給藥：60 只 4～6月齡的SD 大鼠飼養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、硫酸氨基葡萄糖組、右歸丸高劑量組、右歸丸中劑量組和右歸丸低劑量組，每組10只。參照文獻(xiàn)[7-8]，模型組及干預(yù)組采用改良Hulth 法復(fù)制KOA模型。腹腔注射10 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉各組動(dòng)物，無菌條件下縱向切開雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，切口約長(zhǎng)2 cm，逐層分離并暴露關(guān)節(jié)腔，剔除膝前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，注意關(guān)節(jié)軟骨面勿損傷。用潔凈的5 mL注射器吸取生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔3～5次，行抽屜試驗(yàn)陽性后徹底止血，逐層縫合。假手術(shù)組 SD 大鼠從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)只打開關(guān)節(jié)腔，不破壞韌帶和半月板，并保留關(guān)節(jié)軟骨面。術(shù)后連續(xù) 3 d肌肉注射青霉素 20 萬U/d，各組大鼠均在相同條件下，自由飲水，攝食。手術(shù)造模 6 周后，HE染色法觀察假手術(shù)組和模型組關(guān)節(jié)軟骨的病理形態(tài)學(xué)改變，以關(guān)節(jié)軟骨邊緣嚴(yán)重破壞，軟骨細(xì)胞排列紊亂作為模型制備成功的標(biāo)志。將造模成功的動(dòng)物給予藥物干預(yù)，硫酸氨基葡萄糖組灌服硫酸氨基葡萄糖(0.17 g/kg)，右歸丸高、中、低劑量組分別按 4.8、2.4、1.2 g/kg灌服相應(yīng)的藥物，干預(yù) 8周。股動(dòng)脈采血處死各組動(dòng)物，摘取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)固定于4 %多聚甲醛，右側(cè)膝關(guān)節(jié)于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3指標(biāo)測(cè)定：①HE染色觀察軟骨的形態(tài)改變：將固定于4%多聚甲醛的左側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行脫鈣處理后，采用石蠟包埋法制作蠟塊，并用切片機(jī)切片，切片厚度約5 μm，HE 染色，封片、鏡檢并進(jìn)行 Mankin 評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。②軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表達(dá)測(cè)定：用 RNA抽提試劑提取軟骨組織RNA，BioMATE 3S型蛋白、核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定 RNA 含量。用Promega 試劑盒說明書步驟合成 cDNA 第一鏈，按Promega實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒操作說明書進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃、2 min， 變性 95 ℃、15 s，退火 58 ℃、45 s，延伸 60 ℃、 1 min，共 45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品各重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)經(jīng) 2-ΔΔCt處理后進(jìn)行IL-1β、MMP-3和MMP-13基因相對(duì)表達(dá)量分析。③軟骨組織PI3K、pAkt、pmTOR和 Beclin1的蛋白表達(dá)測(cè)定：軟骨組織蛋白質(zhì)的提取用 RIPA 裂解液，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用BCA 法，并調(diào)整點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)濃度為50 μg /10 μL，10 μL/每孔，作SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加抗Rabit Anti-PI3K Polyclonal Antibody、Rabit Anti-pAkt Polyclonal Antibody、Rabit Anti-pmTOR Polyclonal Antibody和Rabit Anti-Beclin1 Polyclonal Antibody 等抗體孵育過夜，滴加山羊抗兔IgG二抗孵育。將ECL Plus 超敏發(fā)光液的A 和 B溶液等體積混勻后滴加于二抗孵育過的PVDF膜上，暗室放置 1 min后置于 Image Lab 3.0 進(jìn)行曝光(單個(gè)曝光時(shí)間10 s，總曝光時(shí)間60 s)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)變化

采用HE染色法對(duì)各組動(dòng)物的軟骨形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面光滑平整，滑膜結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞呈水平排列；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨邊緣嚴(yán)重破壞，軟骨細(xì)胞排列紊亂；右歸丸低、中劑量組關(guān)節(jié)軟骨邊緣不平整，軟骨細(xì)胞排列紊亂；右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細(xì)胞分布偶見不均，關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑。Mankin評(píng)分結(jié)果顯示：模型組大鼠Mankin評(píng)分較假手術(shù)組升高(P<0.01)；右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠Mankin評(píng)分較模型組均降低(P<0.05或P<0.01)。見表1和圖1。

組別Makin score假手術(shù)組0.200±0.089模型組4.920±0.539##硫酸氨基葡萄糖組 2.760±0.317**右歸丸高劑量組 3.050±0.253*右歸丸中劑量組4.140±0.159右歸丸低劑量組4.380±0.621

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.05。

2.2 對(duì)軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13基因表達(dá)的影響

圖1 各組動(dòng)物軟骨組織的病理形態(tài)改變(HE，200×)注：A假手術(shù)組；B 模型組；C 硫酸氨基葡萄糖組；D 右歸丸高劑量組；Fig.1 The pathomorphological changes of the cartilage in each group(HE，200×)E 右歸丸中劑量組；F 右歸丸低劑量組。

模型組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)；右歸丸各干預(yù)組和硫酸氨基葡萄糖組IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表達(dá)較模型組均顯著降低(P<0.01)。見表2。

組別IL-1β(2-ΔΔCt)MMP-3(2-ΔΔCt)MMP-13(2-ΔΔCt)假手術(shù)組1.00±0.091.00±0.091.00±0.03模型組7.50±0.23##5.57±0.04##6.18±0.01##硫酸氨基葡萄糖組3.86±0.11**1.27±0.08**2.74±0.06**右歸丸高劑量組2.56±0.35**1.12±0.10**2.53±0.06**右歸丸中劑量組4.71±0.15**2.44±0.03**3.18±0.04**右歸丸低劑量組5.32±0.49**3.62±0.04**4.03±0.09**

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

表3 右歸丸對(duì)KOA模型大鼠PI3K、pAkt、pmTOR和 Beclin1蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effect of Yougui pill on the protein expressions of PI3K, pAkt, pmTOR, and Beclin1 in KOA

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 對(duì)軟骨組織PI3K、pAkt、pmTOR和Beclin1蛋白表達(dá)的影響

模型組大鼠PI3K、pAkt和pmTOR等蛋白表達(dá)較假手術(shù)組均明顯升高，Beclin1的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)；右歸丸各干預(yù)組和硫酸氨基葡萄糖組PI3K蛋白表達(dá)較模型組均明顯降低，右歸丸中、高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組pAkt和pmTOR等蛋白表達(dá)較模型組均明顯降低，右歸丸高劑量組和和硫酸氨基葡萄糖組Beclin1的蛋白表達(dá)較模型組明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表3和圖2。

圖2 各組大鼠軟骨組織PI3K、pAkt、pmTOR和Beclin1蛋白的表達(dá)注：A 假手術(shù)組；B 模型組；C 硫酸氨基葡萄糖組；D 右歸丸高劑量組；Fig.2 Protein expressions of PI3K, pAkt, pmTOR, and Beclin1 of cartilaginous cell in each groupE 右歸丸中劑量組；F 右歸丸低劑量組。

3 討論

mTOR是一種與細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞分化密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[10]。目前已發(fā)現(xiàn)，以 mTOR 為交匯點(diǎn)的上游信號(hào)通路主要有PI3K/ Akt/mTOR 信號(hào)通路、AMPK/mTOR 信號(hào)通路和某些氨基酸對(duì)mTOR的激活通路。有研究證實(shí)，PI3K/ Akt/mTOR 信號(hào)通路主要參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬[11]。目前有研究認(rèn)為，KOA的發(fā)生是機(jī)體PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活的結(jié)果[12]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活以后，可以影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，從而抑制細(xì)胞自噬[13]。Beclin1是 PI3K/Akt /mTOR信號(hào)通路中重要的負(fù)調(diào)控分子，Beclin-1是一種參與自噬體形成與成熟的調(diào)控蛋白質(zhì)，在細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等機(jī)制中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，Beclin1是重要的KOA治療靶點(diǎn)[14-15]。有研究[16-17]報(bào)道，Becn1和 LC3的表達(dá)在關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中是減少的，mTOR在小鼠膝關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)是增加的。也有研究[18]報(bào)道，OA軟骨的退行性病變可能是通過抑制自噬信號(hào)通路的來調(diào)控的。在本研究中觀察到，模型組PI3K、pAkt和pmTOR等的蛋白表達(dá)均明顯升高， Beclin1的蛋白表達(dá)明顯降低，說明PI3K 能與 mTOR 協(xié)同參加信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，以調(diào)控 KOA大鼠的細(xì)胞自噬。而給予右歸丸干預(yù)后，右歸丸能降低KOA模型鼠PI3K、pAkt和pmTOR等的蛋白表達(dá)，升高Beclin1的蛋白表達(dá)，這說明右歸丸可能作為mTOR的負(fù)性調(diào)控因子，能促進(jìn)自噬，進(jìn)而阻止軟骨組織的退變。

同時(shí)研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，模型組IL-1β、MMP-3和MMP-13的表達(dá)也是增高的，說明KOA的病理演變與KOA患者機(jī)體自身分泌大量的炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶有密切關(guān)系。這與以往的研究報(bào)道是一致的[4,19-20]。而給予右歸丸干預(yù)后，右歸丸能顯著降低KOA模型鼠IL-1β、MMP-3和MMP-13的表達(dá)，進(jìn)一步說明，右歸丸可能通過抑制KOA患者的炎癥反應(yīng)和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解來延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

由于KOA 的發(fā)生、發(fā)展涉及的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，炎癥因子的大量分泌導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶的活化可能是其原因之一；自噬基因及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)KOA 發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用可能是另一重要原因。因此本研究針對(duì)KOA模型大鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與自噬之間關(guān)系的探討，并通過右歸丸的干預(yù)研究，試圖揭示KOA 的發(fā)病機(jī)制及右歸丸的干預(yù)機(jī)制，為臨床治療KOA提供新的思路。但是在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌與PI3K/Akt /mTOR信號(hào)通路的激活是否存在相關(guān)性未做研究，希望在今后的實(shí)驗(yàn)中做進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，通過不同濃度的右歸丸干預(yù)KOA模型大鼠后發(fā)現(xiàn)，右歸丸可以上調(diào)自噬相關(guān)因子的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存，延緩骨關(guān)節(jié)的退變、促進(jìn)骨關(guān)節(jié)的重構(gòu)，這可能是其治療機(jī)制之一。