徐少峰，秦磊*，吳鵬*

黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（黃岡 438000）

合成色素也稱煤焦色素或苯胺色素。所用原料是煤焦油，對人體健康基本上是百害而無一利。有些食品已被禁止使用合成色素：諸如所有的肉及相關(guān)肉制品、魚和海鮮、醋、醬油、腐乳等調(diào)味品。而天然色素受到了人們的關(guān)注與青睞，天然色素營養(yǎng)豐富，適合人體食用。目前，隨著人們對于食品安全的關(guān)注，天然色素有望逐漸代替化學(xué)色素[1]。天然食用色素是從動物、植物、微生物或微生物代謝產(chǎn)物中提取出來的[2]，這些從食物中得到的天然色素更容易受到消費者的歡迎和喜歡，食用起來也更安全。

絕大部分植物色素沒有副作用，安全性能高[3]。與其他的天然食品相比，天然色素最主要的特點是其具有抗氧化活性[4]。植物色素的顏色自然，可以增添顏色，而植物中色素含量較低，提取有限，并且對其分離純化的技術(shù)也不成熟。大部分植物色素穩(wěn)定性都較差，有些植物色素在使用過程中還須添加氧化劑、穩(wěn)定劑來延長商品的貨架期。同時天然色素的優(yōu)點也將會開拓其在醫(yī)藥、日化等方面更開闊的應(yīng)用領(lǐng)域。

紫蘇（學(xué)名：Perilla frutescens（L.）Britt.），別名：桂荏、赤蘇等；唇形科草本植物，可藥食兩用[5-6]。紫蘇色素屬于花青素色素。它的主要成分是紫蘇素（Shisoinn）和紫蘇寧（Shisolaimn）[7]。紫蘇的葉、莖、果均可入藥[8]，作為中藥具有解毒、散寒、行氣和胃的功效[9]。紫蘇起源于中國，主要分布在印度、緬甸、日本、韓國、韓國、印度尼西亞和俄羅斯等國家[10]。紫蘇在美國、日本、加拿大、俄羅斯等國家作為一種美食，主要被用于壽司、配菜和湯中[11]。紫蘇有特異芳香，適應(yīng)性很強，容易栽培。

蔡寧晨[12]在對紫蘇葉花色苷的提取分析及其功能的研究中，通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)：紫蘇葉花色苷在預(yù)防和治療由細菌引起的疾病方面有一定潛能。由吳周和等[13]對紫蘇色素的提取及其熱穩(wěn)定性研究分析可知，在吸收光譜中，530 nm處有最大吸收峰，主要成分是紫蘇花色素苷，使提取液呈紅色。另外在420 nm處也出現(xiàn)了一較大的吸收峰，據(jù)推測，其成分可能是葉綠素及黃酮類化合物，可通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將葉綠素等盡可能蒸出，最后得到紫蘇色素的紫紅色濃縮液，再測其吸光度發(fā)現(xiàn)420 nm處沒有吸收峰。

隨著功能性食品添加劑市場的擴張，天然食用色素將會以保健品的形式添加出現(xiàn)，天然植物色素最大的缺點就是穩(wěn)定性很差，提取后顏色易變化，而我國植物色素的有些生產(chǎn)廠家技術(shù)落后，設(shè)備簡陋，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性更差[14]。由苑玉莉等[15]對紫蘇中花色素的提取及儲藏穩(wěn)定性的研究得出，紫蘇花色素苷的儲藏條件是冷凍、避光、隔氧。

而且徐建越[17]對紫蘇色素的提取及理化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，升高提取溫度、延長提取時間可提高提取率。紫蘇色素色調(diào)變化大，穩(wěn)定性差。紫蘇色素對低熱（＜60℃）較穩(wěn)定，對高熱（＞80℃）穩(wěn)定性較差[16]。紫蘇色素在各種介質(zhì)中熱穩(wěn)定性大小的排列順序為：檸檬酸＞淀粉＞蔗糖=CaCl2＞NaCI＞苯鉀酸鈉＞VC。故而可以應(yīng)用于酸性飲料、水果制品、乳酸飲料等中[17]。長時間的光照也會對紫蘇葉花色苷造成影響，隨著光照時間的增長，紫蘇葉花色苷的色彩密度和聚合色素都有一定程度的降低。由陳勇等[18]對不同pH條件下紫蘇色素降解動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)：對于不同的pH而言，紫蘇色素?zé)峤到夥磻?yīng)隨著pH的增大而加快。故酸性環(huán)境有利于減少紫蘇色素的降解。

劉玉萍[19]通過離心過濾的方法提取紫蘇色素得出了紫蘇色素在可見光范圍內(nèi)的最大吸收峰為360 nm，由L16(45)正交試驗確定了影響色素提取效果的最主要因素是料液比。并得出紫蘇色素提取的最佳工藝條件：超聲波頻率為中頻（47.6 kHz），提取溶劑為55%乙醇，提取時間15 min，提取溫度60℃，料液比1∶15（g/mL）。吳周和等[13]以酸性甲醇為提取溶劑，得出了料液比對提取率影響最為顯著。紫蘇葉色素的最佳提取工藝條件為：提取劑為1% HCl-甲醇溶液，提取溫度為50℃，提取時間為3 h，料液比為1∶15（g/mL）[20]。由前人的試驗結(jié)果可以看到，大家所得的結(jié)果不盡相同，當(dāng)然這也可能是儀器誤差、溫度誤差、操作誤差等的存在以及所選擇的試劑不同所造成的。

超聲波輔助提取是利用超聲場的方法從天然產(chǎn)物中提取活性成分。其原理是在存在于物質(zhì)中的微氣核空化核在超聲場的作用下產(chǎn)生振動、生長和崩潰的過程，即超聲空化效應(yīng)，從而產(chǎn)生局部的高溫高壓，增強物質(zhì)在溶劑中的溶解能力[21]。

試驗通過超聲波輔助提供一種優(yōu)化紫蘇色素提取效果的工藝方案，采用單因素試驗和正交試驗分析得到最佳提取工藝條件，進而為實現(xiàn)紫蘇色素提取的工業(yè)擴大化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉經(jīng)烘干粉碎后備用；無水乙醇（分析純）；蒸餾水（實驗室自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

DFT-200C 200克手提式萬能高速粉碎機，上海比朗儀器有限公司；YP1201N電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SP-723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；

1.3 方法

1.3.1 確定最大吸收波長

稱取已備好的紫蘇粉末0.200 0 g為一份的用量，以料液比1∶30（g/mL）加入提取溶劑無水乙醇6 mL，在超聲功率240 W下，超聲9 min后將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，通過紫外可見分光光度計在400～600 nm進行全波段掃描，測得最大吸收波長為415 nm。

1.3.2 超聲波輔助提取紫蘇色素的單因素試驗

主要考慮以下三個因素對提取效果的影響：超聲的時間，超聲的功率，料液比。

超聲時間對提取紫蘇色素的影響：稱取紫蘇粉末0.200 0 g五份，以料液比1∶30（g/mL）加入提取溶劑無水乙醇6 mL，在超聲功率240 W下，由不同的超聲時間（6，12，18，24和30 min），將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，使用紫外可見分光光度計檢測它們在415 nm處的吸光度。

超聲功率對提取紫蘇色素的影響：稱取紫蘇粉末0.200 0 g五份，以料液比1∶30（g/mL）都加入提取溶劑無水乙醇6 mL，由不同的超聲功率（180，240，300，360和420 W），超聲9 min后將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，使用紫外可見分光光度計檢測它們在415 nm處的吸光度。

料液比對提取紫蘇色素的影響：稱取紫蘇粉末0.200 0 g五份，由不同的料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（g/mL））分別加入對應(yīng)量的提取溶劑無水乙醇，在超聲功率240 W下，超聲9 min后將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，用紫外可見分光光度計檢測它們在415 nm處的吸光度。

1.3.3 正交試驗確定最佳提取工藝

超聲時間、超聲功率、料液比對紫蘇色素的提取效果都有或多或少的影響。通過正交試驗分析這3個因素在3水平上對紫蘇色素提取效果的影響大小及最優(yōu)值，設(shè)計如表1所示。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對提取效果的影響

2.1.1 超聲時間對紫蘇色素提取效果的影響

試驗結(jié)果見圖1。紫蘇色素提取的吸光度隨超聲時間的增大而增大。但到了24 min之后，紫蘇色素提取的吸光度提高變緩，應(yīng)該是比較接近最佳時間了，在五組試驗中30 min為最佳提取時間。關(guān)鍵是紫蘇色素確實極不穩(wěn)定，所以沒有接著繼續(xù)進行后續(xù)試驗。

2.1.2 超聲功率對紫蘇色素提取效果的影響

試驗結(jié)果見圖2，紫蘇色素提取液的吸光度在超聲功率為360 W之前呈增長態(tài)勢，這是因為隨著超聲功率的提高，紫蘇色素在提取溶劑中的傳質(zhì)速率加快，溶解速度也加快，體現(xiàn)了超聲波在破壞細胞壁結(jié)構(gòu)來促使細胞內(nèi)成分溶出的高效性，所以紫蘇色素提取的效果提高。超聲功率超過360 W之后吸光度就下降了，是因為超聲功率太大了，紫蘇色素的結(jié)構(gòu)可能被破壞，使其含量下降。說明在超聲功率360 W時紫蘇色素的提取吸光度最大。故選擇360 W為最佳提取超聲功率。

圖1 超聲時間對提取效果的影響

圖2 超聲功率對提取效果的影響

2.1.3 料液比對紫蘇色素提取效果的影響

試驗結(jié)果見圖3，開始吸光度隨料液比的增大而增大，這是因為料液比增大，提取溶劑用量增大，紫蘇色素溶解量就增大。紫蘇色素的提取吸光度在料液比為1∶50（g/mL）時有最大值，之后又呈下降趨勢，是因為溶劑過大了，紫蘇色素提取溶劑中的傳質(zhì)速率減小從而使其溶解量減小，導(dǎo)致提取效果的下降，同時，溶劑用量太大也會造成浪費。故選擇1∶50（g/mL）為最佳提取料液比。

圖3 料液比對提取效果的影響

2.2 正交試驗結(jié)果及分析

A、B、C分別表示超聲時間、超聲功率、料液比這三個因素，D表示空白，經(jīng)過正交試驗得出的結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

由表3可得，影響紫蘇色素提取效果的因素的主次順序是A＞B=C，即超聲時間＞料液比=超聲功率，超聲時間對紫蘇色素提取效果影響最大，料液比和超聲功率的影響一樣。其最優(yōu)組合是A3B3C3，故超聲波輔助提取紫蘇色素的最佳工藝條件是超聲時間為30 min，料液比為1∶60（g/mL），超聲功率為420 W。

表2 正交試驗結(jié)果表

表3 方差分析表

3 討論與結(jié)論

試驗中發(fā)現(xiàn)紫蘇色素不穩(wěn)定，放置后提取溶液會由偏暗橙黃色變?yōu)辄S綠色。將提取液抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至略帶黏稠狀的深紅色液體，即得到紫蘇色素樣品。在真空濃縮的后期，出現(xiàn)深黃綠色的凝塊，可能是葉綠素析出[13]。試驗得到的紫蘇色素為黃綠色，比較透亮，另一方面可能是其中還有未分離出來的葉綠素的緣故。由蔡寧晨[12]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)處于酸性條件尤其是pH為2～4的環(huán)境中，紫蘇葉花色苷是比較穩(wěn)定的。pH≥7時，紫蘇葉花色苷會被分解為其他物質(zhì)，呈淺黃色。

試驗結(jié)果分析中，方差分析表里沒能得到顯著性，可能是因為研究的影響因素有限，只是研究了三個因素的影響。食品的色澤是食品的一項重要感官指標，要想真正用上天然色素，并且廣泛多領(lǐng)域使用，就急需研制護色劑或制定出良好的護色方案。

正交優(yōu)化所得的超聲波輔助提取紫蘇色素的最佳提取工藝條件為：超聲時間30 min，料液比1∶60（g/mL），超聲功率420 W。紫蘇資源豐富又分布廣泛，是提取天然色素的較佳原料，為紫蘇色素提取的工業(yè)化提供了理論基礎(chǔ)。