劉霞*，楊瑩，劉劍輝

贛南醫(yī)學(xué)院（贛州 341000）

杜仲葉為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides）的干燥葉[1]，其藥理作用十分顯著，對(duì)于防治骨質(zhì)疏松、改善疲勞、防止衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和降血壓等具有較好的效果，和杜仲皮的有效成分和藥理作用相似[2-3]。杜仲葉綠原酸是杜仲中重要的藥物活性物質(zhì)之一，其抗氧化作用和抑菌活性較強(qiáng)，對(duì)多種菌如大腸桿菌、乳房鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌、白色葡萄球菌等均具有抑制作用[4-5]。目前關(guān)于杜仲葉中綠原酸的提取方法常用的有超聲法[6]、微波輔助提取法[7]及生物酶法[8]等。但這些方法存在成本高、溶劑耗量大且提取率低等問題。研究一種工藝條件溫和、操作簡(jiǎn)便、成本低且提取率高的綠原酸提取工藝對(duì)杜仲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大。

聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）-200成本較低、不易揮發(fā)、性質(zhì)比較穩(wěn)定、安全無(wú)毒，是一種環(huán)保溶劑[9]。纖維素酶法能有效水解細(xì)胞壁上的纖維素，加速有效成分溶出，從而提高提取效果[10-11]。目前采用酶法輔助PEG-200提取杜仲葉綠原酸的研究仍鮮見報(bào)道。試驗(yàn)以杜仲葉為原材料，采用酶法輔助PEG-200提取綠原酸，并用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)方法優(yōu)化其提取工藝，從而為杜仲葉資源的綜合開發(fā)利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

杜仲葉藥材，市售，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院程齊來(lái)教授鑒定為杜仲科植物杜仲的葉。

綠原酸對(duì)照品，天津一方科技有限公司；纖維素酶（5×104U·g-1），江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

SPECORD 50 PLUS型紫外分光光譜儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SQP型電子天平，塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FS500Y-3型搖擺式粉碎機(jī)，廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司；Hei-VAP Value Digital G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德祥Tengent；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇市城東新瑞儀器廠；SHZ-III循環(huán)水式真空泵，上海亞榮生化儀器廠；DHG9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PB-10酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取10.16 mg的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用30% PEG-200定容至100 mL，配制101.6 μg·mL-1的母液，再精密量取0，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 mL母液，分別置于10 mL容量瓶中，加30% PEG-200至刻度，搖勻，靜置，配制成0，3.12，6.23，9.35，12.47和15.59 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液在329 nm的吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.051C+0.003 9，R2=0.999 8。

1.2.2 杜仲葉綠原酸的提取

將50℃恒溫烘干后的杜仲葉粉碎，過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取5.0 g杜仲葉粉末，置于250 mL具塞錐形瓶中，按不同的料液比加入30%的PEG-200，鹽酸調(diào)pH，充分?jǐn)嚢瑁偬砑舆m量的纖維素酶，在不同溫度下恒溫酶解一定時(shí)間后，在80℃條件下回流提取15 min，趁熱過(guò)濾，濾液適當(dāng)減壓濃縮，并用30% PEG-200定容于50 mL的容量瓶中，備用。

1.2.3 綠原酸提取率測(cè)定

精密量取上述提取液，并按一定比例稀釋后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線下的測(cè)定方法測(cè)吸光度，計(jì)算綠原酸提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)研究酶用量、料液比、酶解溫度、pH及酶解時(shí)間對(duì)杜仲葉綠原酸提取效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，酶解溫度對(duì)綠原酸提取率影響不大，固定酶解溫度50℃。以酶用量（A）、料液比（B）、pH（C）及酶解時(shí)間（D）為自變量，以-1，0和+1代表自變量的低、中、高水平，以綠原酸提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶用量對(duì)杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖1可以看出，當(dāng)酶用量逐漸增加至1.2%時(shí)，綠原酸提取率增幅較大；當(dāng)酶用量超過(guò)1.2%時(shí)，綠原酸的提取率反而呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槊赣昧吭黾拥揭欢ǔ潭葧r(shí)，酶與底物濃度處于相對(duì)飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加酶用量，會(huì)導(dǎo)致部分酶不僅不能與底物結(jié)合，反而會(huì)抑制綠原酸成分的浸出，因而綠原酸提取率有所下降[12]。因此選擇酶用量的比例為1.2%。

2.1.2 料液比對(duì)杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖2可知，隨著料液比逐漸增加，綠原酸提取率先增加后降低，當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時(shí)綠原酸提取率達(dá)到最大值，之后提取率開始下降，因此選擇1∶25（g/mL）為最佳料液比。

圖1 酶用量對(duì)綠原酸提取率的影響

圖2 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

2.1.3 酶解溫度對(duì)杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖3可以看出，隨著酶解溫度的增加，綠原酸提取率先逐步增加。當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到最大值。后續(xù)隨著酶解溫度的增加，綠原酸提取率開始下降。這是因?yàn)槔w維酶的活力都有最適溫度，偏離最適溫度會(huì)引起酶的失活[13]。因此，試驗(yàn)的酶解溫度定為50℃。

圖3 酶解溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

2.1.4 pH對(duì)杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖4可知，隨著pH的增加，綠原酸提取率先呈上升趨勢(shì)。當(dāng)pH達(dá)到4.5時(shí)，提取率達(dá)到最大值，而后提取率逐步下降。這可能是酸性纖維素酶在pH 4.5時(shí)活力作用最強(qiáng)，穩(wěn)定性最好。故試驗(yàn)選擇最佳pH 4.5。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的增加，綠原酸提取率先呈逐步上升趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值，之后繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提取率明顯下降。這是由于綠原酸本身的不穩(wěn)定性，長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)導(dǎo)致部分綠原酸發(fā)生異變和分解，因而提取率下降。故試驗(yàn)將最佳酶解時(shí)間定為2 h。

圖4 pH對(duì)綠原酸提取率的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得出方差分析表，見表3。

通過(guò)多元回歸擬合分析得到杜仲葉中綠原酸提取率（Y）與酶用量（A）、料液比（B）、pH（C）和酶解時(shí)間（D）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=-17.705 4- 1.362 5A-0.146 8B+10.488 3C-0.196 7D+0.105 0AB+ 0.275 0AC-0.450 0AD+0.037 0BC+0.050 0BD+0.190 0CD- 0.802 1A2-4.483 3E-003B2-1.333 3C2-0.398 3D2。

由表3可以看出回歸方程的p＜0.01，表明此回歸模型達(dá)到極顯著水平。模型的相關(guān)系數(shù)R2=95.65%，調(diào)整系數(shù)R2Adj=91.31%，均大于90%，表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)結(jié)果誤差小，可用于擬合杜仲葉中綠原酸的最佳提取工藝。一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、AD、BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（p＜0.05），表明酶用量、料液比、pH和酶解時(shí)間對(duì)杜仲葉中綠原酸提取率影響顯著，且影響順序（主→次）為酶用量＞酶解時(shí)間＞料液比＞pH。交互項(xiàng)AD、BC的p＜0.05，表明酶用量與酶解時(shí)間、料液比與pH的交互作用對(duì)杜仲葉中綠原酸提取率影響顯著，交互項(xiàng)AB、BD的p＜0.01，表明酶用量與料液比、料液比與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)杜仲葉綠原酸的提取率影響達(dá)到了極顯著的水平。

表2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析及最佳提取工藝研究

各試驗(yàn)因素間的交互作用對(duì)杜仲葉綠原酸提取率影響的3D分析結(jié)果見圖6。由圖6可知，酶用量對(duì)杜仲葉綠原酸提取率影響最顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面坡度較陡峭；酶解時(shí)間和料液比影響次之，表現(xiàn)為曲面稍平滑；最后為pH，表現(xiàn)為曲面更平緩。各試驗(yàn)因素間的交互作用對(duì)杜仲葉綠原酸提取率影響與表3中交互相的方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，得到最佳工藝參數(shù)：酶用量0.8%，料液比1∶20（g/mL），pH 4.4，酶解時(shí)間1.6 h。在此工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果得到的實(shí)際提取率為3.15%，與預(yù)測(cè)值3.23%相差較小，相對(duì)誤差為2.48%，說(shuō)明此模型合理可靠，能夠較好地?cái)M合杜仲葉綠原酸的提取過(guò)程。

圖6 各兩因素交互作用對(duì)杜仲葉綠原酸提取率影響的響應(yīng)面圖

2.3 不同提取方法的對(duì)比

由表4可知，相比單技術(shù)回流法，酶法聯(lián)合回流法提取杜仲葉中綠原酸雖耗時(shí)更長(zhǎng)，但得率提高近1倍，說(shuō)明在回流法的基礎(chǔ)上增加酶預(yù)處理步驟可有效提高杜仲葉中綠原酸的得率。

表4 不同提取方法提取綠原酸的比較（±s，n=3）

表4 不同提取方法提取綠原酸的比較（±s，n=3）

序號(hào) 提取方法 提取時(shí)間 杜仲葉綠原酸提取率/%1 酶法聯(lián)合回流法 1．85 h 3．15±0．32 2 回流法 15 min 1．87±0．19

3 討論與結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面分析方法的優(yōu)化，采用酶法輔助PEG-200提取杜仲葉中綠原酸的最佳工藝條件為：酶用量0.8%、料液比1∶20（g/mL）、pH 4.4、酶解時(shí)間1.6 h。在此試驗(yàn)條件下實(shí)際提取率為3.15%，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明此模型合理可靠，可以很好地分析和預(yù)測(cè)杜仲葉中綠原酸的提取工藝。此法相比單技術(shù)回流法，雖耗時(shí)更長(zhǎng)，但得率提高近1倍，說(shuō)明在回流法的基礎(chǔ)上增加酶預(yù)處理步驟可有效提高杜仲葉中綠原酸的得率。此研究結(jié)果可為綠原酸提取純化工藝的進(jìn)一步研究提供一定的參考依據(jù)。