張思琦，何 佳，賀凌霄，薛 剛，孫聚濤，李曉輝，段杜薇，徐世曉*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)文化路95 號(hào) 450002

2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，鄭州市鄭東新區(qū)榆林南路16 號(hào) 450000

冷杉醇為賴百當(dāng)類二萜化合物，是煙草葉面分泌的一種化學(xué)物質(zhì)，多存在于香料煙和部分雪茄煙中，烤煙、白肋煙、馬里蘭煙中一般不存在［1］。經(jīng)調(diào)制和醇化后，90%以上的冷杉醇、賴百當(dāng)烯二醇氧化降解，產(chǎn)生多種降賴百當(dāng)類化合物，其中降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯等物質(zhì)具有強(qiáng)烈的龍涎香氣［2］。Sallaud 等［3］通 過(guò) 轉(zhuǎn) 化 二 倍 體 林 煙 草（Nicotiana sylvestris），發(fā)現(xiàn)CPS2 和ABS 基因直接參與冷杉醇的合成。在賴百當(dāng)類合成途徑中，香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）折疊成環(huán)在柯巴基焦磷酸合酶（CPS2）催化作用下合成8-OH-CPP（8-羥基-柯巴基焦磷酸）；在冷杉醇合成酶（ABS）和香紫蘇醇合成酶（SCLS）催化作用下，8-OH-CPP 分別合成冷杉醇和賴百當(dāng)烯二醇［4］。

CRISPR/Cas9 是利用向?qū)NA（gRNA）與基因靶位點(diǎn)序列結(jié)合，在Cas9 蛋白的作用下對(duì)靶DNA 分子進(jìn)行剪切，DNA 分子發(fā)生斷裂后會(huì)自動(dòng)進(jìn)行修復(fù)，在修復(fù)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)堿基的插入、缺失和替換，這可能會(huì)導(dǎo)致翻譯提前終止，進(jìn)而使原有的基因功能喪失［5-6］。CRISPR/Cas9 技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物遺傳改良和品種培育［7-10］。Wang 等［11］敲除小麥中3 個(gè)TaMLO 同源白粉病易感基因，得到了對(duì)白粉病具有抗性的小麥；ZHOU 等［12］創(chuàng)建了水稻溫敏核雄性不育系；Shi 等［13］獲得了玉米AGROS8 突變體，該突變體對(duì)乙烯利的敏感性降低，抗旱性提高，在干旱脅迫下籽粒產(chǎn)量仍較高。CRISPR/Cas9 技術(shù)在煙草上也有較多應(yīng)用。潘陽(yáng)等［14］對(duì)腺毛負(fù)向調(diào)控基因NtCycB2 進(jìn)行敲除，提高了煙草腺毛密度，同時(shí)中性香氣成分含量提高。聶夢(mèng)云等［15］敲除萜類合成基因NtDXR 后，獲得白化煙株，推測(cè)NtDXR 基因的突變能阻斷煙草質(zhì)體色素的合成；王姍姍等［16］對(duì)煙草腋芽形成關(guān)鍵基因NtLS 進(jìn)行敲除，得到部分蛋白翻譯錯(cuò)誤的T0代突變植株。8306 品熙是以葉面分泌物為指標(biāo)，經(jīng)定向選育獲得的烤煙新品系，其西柏烷類化合物和石油醚提取物含量提高，同時(shí)中性香氣物質(zhì)總量和重要致香物質(zhì)如茄酮，巨豆三烯酮等含量提高［17-18］。與常規(guī)烤煙品種不同，8306 品系能夠合成冷杉醇，對(duì)卷煙香氣有負(fù)面影響［19-20］?？掳突沽姿岷厦富颍–PS2，copal-8-ol diphosphate hydratase）可編碼冷杉醇，在烤煙基因組中為單拷貝。目前對(duì)煙草CPS2 基因功能及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制的研究尚鮮見報(bào)道。為此，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)煙草CPS2 基因進(jìn)行敲除，旨在明確CPS2基因在煙草萜類代謝途徑中的作用，消除8306 品系煙葉雜氣，改良煙草香氣品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 煙草材料及載體試劑盒

8306 為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)自選高香氣烤煙品系，CRISPR/Cas9 載體試劑盒和檢測(cè)引物由武漢天問(wèn)生物科技有限公司合成。在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無(wú)菌育苗，置于恒溫恒濕人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光周期為14 h 光照/10 h 黑暗；光照強(qiáng)度為1 500 Lx，溫度為（27±1）℃。

1.2 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI 提供的mRNA 序列及對(duì)應(yīng)的基因組序列信息，設(shè)計(jì)2 個(gè)CRISPR 靶位點(diǎn)，以提高基因打靶效率。靶位點(diǎn)1 序：GGAAACCCAAGCTGTGTC AT；靶位點(diǎn)2序列：CATGAACCATCAGAAAGTTG。設(shè)計(jì)載體構(gòu)建的PCR 引物以及陽(yáng)性克隆測(cè)序引物（表1），引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物合成后，采用重疊延伸PCR 擴(kuò)增出含有靶位點(diǎn)的片段，PCR 片段利用南京諾維贊生物科技有限公司的重組酶克隆至最終的CRISPR 表達(dá)載體。將構(gòu)建的CRISPR 載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過(guò)菌落PCR 篩選陽(yáng)性克隆。具體方法：利用Golden Gate 克隆法，將兩個(gè)sgRNA 組合在1 個(gè)載體中，分別用引物對(duì)P1-P2 和P3-P4 獲得兩個(gè)單獨(dú)的PCR產(chǎn)物。使用重疊延伸PCR 法利用引物對(duì)P5-P6 將這兩個(gè)片段連接，擴(kuò)增出含有靶位點(diǎn)的片段。將目標(biāo)序列連接到兩個(gè)Bsa I 酶切位點(diǎn)之間，連接方法為一步克隆法。為進(jìn)一步確定靶位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，靶位點(diǎn)片段與表達(dá)載體重組后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，挑選4 個(gè)克隆，利用載體引物KN48-inf T2 as 進(jìn)行 菌落PCR 驗(yàn)證。

表1 PCR 擴(kuò)增引物Tab.1 PCR primers

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

參照曾千春等［21］方法，成熟種子使用加入75%酒精和10%的次氯酸鈉進(jìn)行消毒后，接種于萌發(fā)培養(yǎng)基，光照（光周期為14 h 光照/10 h 黑暗；光照強(qiáng)度為1 500 Lx）下培養(yǎng)45 d。使用打孔器取0.5 cm 左右的葉片，轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d。在含50 mg/L 卡那霉素培養(yǎng)基上活化農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌菌液侵染葉盤，棄去菌液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。用滅菌蒸餾水及含有抗生素的水溶液清洗葉盤，吸干葉盤表面水分后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，待分化后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)生根培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化植株，培養(yǎng)1個(gè)月后至盆缽中土培。

1.4 轉(zhuǎn)化植株目標(biāo)基因靶位點(diǎn)序列突變檢測(cè)

轉(zhuǎn)化植株于2017 年5 月上旬移栽于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)大棚盆缽中，常規(guī)水肥管理。在苗期剪取轉(zhuǎn)化植株葉片，使用Plant DNAIsolation Reagent（日本TAKARA公司）提取煙草葉片DNA，利用CTAB法抽提DNA。設(shè)計(jì)特異引物NPTII 序列，進(jìn)行PCR 陽(yáng)性檢測(cè)。NPTII-dF：ACTGGGCACAACAGACAATCG；NPTII-dR：GCATCAGCCATGATGGATACTTT。待確認(rèn)外源DNA 片段插入后，為了檢測(cè)靶位點(diǎn)的突變情況，根據(jù)CPS2 基因序列及靶位點(diǎn)位置，設(shè)計(jì)引物17KN48序列對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。17KN48-dF：ATCATAGCGGAATTGTTTGTCTC；17KN48-dR：TCC GTATAGATACCTAAGCGATCTG。將擴(kuò)增出的目的條帶進(jìn)行純化，送至北京擎科生物公司測(cè)序。利用BioEdit 7.0 軟件將測(cè)序結(jié)果與模板序列進(jìn)行比對(duì)。PCR 擴(kuò)增體系20μL：1μL DNA，2μL 10×PCR buffer，0.4 μL dNTP mixture，正反引物各0.2μL，0.2 μL rTaq DNApolymerase，加DEPC水補(bǔ)充至20μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。配制1%的瓊脂糖凝膠，放置電泳槽中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5 轉(zhuǎn)化植株二萜類關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

待轉(zhuǎn)化植株葉齡60 d 時(shí)，取中部葉置于液氮中速凍，然后存放于-80 ℃冰箱中，備用。采用CTAB法提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄使用PrimerScript RT reagent Kit（日本TaKaRa 公司）將上述RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒 光 定 量PCR：設(shè) 計(jì)CPS2、ABS、CYC-1、CYP71D16、DXR 和Actin（內(nèi)參基因）序列引物（表2）。反應(yīng)體系為20 μL。包括2.0 μL 10×PCR Buffer，1 μL Mg2+，0.5 μL dNTPs，0.3 μL SYBR（20×），正反引物各0.5 μL，0.2 μL Taq DNA Polymerase，1 μL Template，14 μL ddH2O。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40 個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線，從60 ℃緩慢升溫至95 ℃，每次采集5 次熒光信號(hào)。依據(jù)Ct 值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，并作圖。

表2 熒光定量引物序列Tab.2 Sequences of primers for fluorescence quantitative PCR

1.6 轉(zhuǎn)化植株葉面分泌物及GGPP 含量測(cè)定

選取葉齡60 d 時(shí)轉(zhuǎn)化植株的中部葉，一部分沿主脈兩側(cè)剪切成葉圓片。另一部分將鮮葉用液氮速凍，冷凍干燥并打碎。將葉圓片置于500 mL 二氯甲烷中浸提，參照韓錦峰等［22］的方法，每片葉圓片每次浸提2 s，反復(fù)浸提4 次。收集二氯甲烷溶液，向其中加入1 mL 含正-17-烷醇的內(nèi)標(biāo)，同時(shí)加入10 g 無(wú)水硫酸鈉。過(guò)濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至50 mL，經(jīng)氮吹儀吹干和衍生化反應(yīng)后，使用GC/MS 聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司HP-5890Ⅱ-5972）采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析［23］。同時(shí)取0.05 g 鮮葉液氮樣研磨成粉末，加入1 mL 甲醇溶劑測(cè)定香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.7 農(nóng)藝性狀調(diào)查

轉(zhuǎn)化植株葉齡60 d 時(shí)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法［24］測(cè)定株高、莖圍、腰葉長(zhǎng)、腰葉寬、有效葉片數(shù)和節(jié)距等指標(biāo)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistic 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用新復(fù)極差法分析均值差異的顯著性，采用Excel 2007 軟件繪圖制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA 靶位點(diǎn)選擇及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)cds 序列與基因組序列（CPS2，Genebank HE588139.1）在第2 外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)2 個(gè)gRNA 靶位點(diǎn)序列。靶點(diǎn)長(zhǎng)20 bp，靶位點(diǎn)1 序列為GGAAACCCAAGCTGTGTCAT，靶位點(diǎn)2 序列為CATGAACCATCAGAAAGTTG。靶位點(diǎn)在cds 區(qū)域的位置見圖1，分別構(gòu)建靶點(diǎn)1 和靶點(diǎn)2 的表達(dá)載體pRGEB32-Cas9-NPT II-CPS2-gRNA，見圖2。利用靶位點(diǎn)接頭引物，擴(kuò)增中間載體獲得含有靶位點(diǎn)的片段，大小約300 bp 的片段（圖3），表明2個(gè)靶點(diǎn)gRNA 元件順利插入到載體上。圖4 顯示，篩選到2 個(gè)陽(yáng)性克隆菌落，PCR 產(chǎn)物大小約400 bp，挑選出的4 號(hào)克隆測(cè)序結(jié)果表明，2 個(gè)靶位點(diǎn)序列都與所設(shè)計(jì)靶點(diǎn)序列相同，說(shuō)明構(gòu)建的pRGEB32/Cas9-CPS2-gRNA 載體可進(jìn)行下一步農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖1 2 個(gè)gRNA 靶點(diǎn)在CPS2 基因中的位置Fig.1 Positions of the two gRNA targets in CPS2 gene

圖2 pRGEB32-Cas9-NPT II-CPS2-gRNA 重組載體構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant vector pRGEB32-Cas9-NPT II-CPS2-gRNA

圖3 靶位點(diǎn)片段擴(kuò)增Fig.3 Amplification of target fragment

圖4 菌液PCR 檢測(cè)Fig.4 Bacterial liquid PCR detection

2.2 轉(zhuǎn)化植株靶位點(diǎn)序列突變的差異分析

將所獲得36 株T0代轉(zhuǎn)化再生植株進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖5、圖6。最終得到31 株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，靶位點(diǎn)中間序列缺失后擴(kuò)增產(chǎn)物大小約356 bp。對(duì)陽(yáng)性植株CPS2 基因進(jìn)行測(cè)序表明，T0代共獲得7 株成功敲除植株，突變比例達(dá)22.6%。突變均發(fā)生在靶點(diǎn)2 上，其中T0-26、T0-27、T0-36、T0-42 插入單個(gè)A 堿基，T0-45、T0-46插入單個(gè)C 堿基，T0-47 插入單個(gè)T 堿基（圖7）。根據(jù)峰型圖及子代株系測(cè)序結(jié)果，確定T0-26 為純合型堿基插入，其余為雜合型堿基插入。對(duì)突變株系編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)比對(duì)，結(jié)果見圖8。由于靶點(diǎn)2 插入單個(gè)堿基A/T/C 引發(fā)移碼，致使編碼肽鏈提前遇到終止密碼子，翻譯的氨基酸鏈大幅縮短。

圖5 T0代轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR 陽(yáng)性檢測(cè)Fig.5 Identification of T0 generation transformed plants by PCR detection

圖6 T0代轉(zhuǎn)化植株靶位點(diǎn)區(qū)域PCR 檢測(cè)Fig.6 PCR detection at target sites in T0 generation transformed plants

圖7 靶位點(diǎn)區(qū)域PCR 產(chǎn)物測(cè)序文件解碼結(jié)果Fig.7 Decoding results of sequencing files for PCR products of target sites

圖8 8306 與T0代轉(zhuǎn)化植株預(yù)測(cè)氨基酸序列分析Fig.8 Analysis of the predicted amino acid sequences of 8306 and T0 generation transformed plants

2.3 轉(zhuǎn)化植株二萜類物質(zhì)關(guān)鍵基因的差異表達(dá)分析

qPCR 檢測(cè)結(jié)果見圖9，DXR 是脫氧木酮糖磷酸代謝途徑（DXR）中二萜類化合物合成的上游關(guān)鍵基因。與未編輯植株8306 相比，T0代轉(zhuǎn)化植株DXR 相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)。CYC-1 和CYP71D16 共同控制西柏烷類化合物的合成。CYC-1 以T0-46、T0-47 的表達(dá)量最高，T0-36 和T0-46 與對(duì)照相比表達(dá)量差異不大，T0-26、T0-27 和T0-45 與對(duì)照相比表達(dá)量均顯著下降。CYP71D16 以T0-27 植株表達(dá)量最高，其他植株表達(dá)量與對(duì)照間差異不大。CPS2 和ABS 共同控制賴百當(dāng)類化合物的合成。與8306 相比，T0代轉(zhuǎn)化植株CPS2 的基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明T0代轉(zhuǎn)化植株中CPS2 轉(zhuǎn)錄受到抑制。同時(shí)ABS 的基因相對(duì)表達(dá)量也大幅降低，說(shuō)明敲除CPS2 的同時(shí)也影響冷杉醇下游基因ABS的表達(dá)。

圖9 8306 與T0代轉(zhuǎn)化植株二萜類物質(zhì)關(guān)鍵基因表達(dá)差異比較Fig.9 Comparison of expressions of key diterpenoids genes among 8306 and T0 transformed plants

2.4 轉(zhuǎn)化植株葉面分泌物及GGPP含量的差異分析

如圖10 所示，賴百當(dāng)類物質(zhì)主要包括冷杉醇和賴百當(dāng)烯二醇，T0代轉(zhuǎn)化植株冷杉醇和賴百當(dāng)烯二醇含量較8306 顯著降低，T0-45 冷杉醇含量最低。西柏烷類化合物包括西柏三烯一醇和西柏三烯二醇，與對(duì)照相比T0-46、T0-42、T0-47、T0-36 西柏三烯一醇含量顯著升高，其余植株差異不顯著；西柏三烯二醇含量除T0-27 差異不顯著外，其余均出現(xiàn)小幅降低；T0-42 蔗糖酯類物質(zhì)含量顯著升高，T0-47、T0-45 顯著降低，其余植株差異不顯著；T0-42 和T0-46 烷烴類物質(zhì)含量顯著升高，而T0-26、T0-27、T0-36、T0-45 和T0-47 顯著降低。與對(duì)照相比T0代轉(zhuǎn)化植株GGPP 含量均顯著升高，且T0-47 的GGPP 含量最高。

總體來(lái)看，敲除CPS2 后，冷杉醇和賴百當(dāng)烯二醇含量減少，萜類合成前體GGPP 含量大幅提高，而西柏三烯一醇含量差異較大，西柏三烯二醇出現(xiàn)小幅降低。蔗糖酯、烷烴等其他代謝物質(zhì)變化無(wú)明顯規(guī)律。

2.5 轉(zhuǎn)化植株農(nóng)藝性狀指標(biāo)分析

農(nóng)藝性狀指標(biāo)調(diào)查結(jié)果見表3。與8306 相比，T0代轉(zhuǎn)化植株的株高、莖圍、葉間距、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬均增加；T0-27、T0-45 和T0-46 的留葉數(shù)均增加1 片，其他植株留葉數(shù)有所減少。

3 討論

圖10 8306 與T0代轉(zhuǎn)化植株葉面分泌物及香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）差異比較Fig.10 Comparison of leaf surface exudates and GGPP among 8306 and T0 generation transformed plants

表3 8306 與T0代轉(zhuǎn)化植株的農(nóng)藝性狀的比較Tab.3 Comparison of agronomic traits among 8306 and T0 transformed plants

本研究中利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，共獲得了7株靶位點(diǎn)序列突變的煙株，突變比例達(dá)22.6%。CPS2 基因的突變均發(fā)生在PAM 上游第3 堿基和第4 堿基之間，突變類型為單堿基A/T/C 的插入，以單堿基A 或T 插入所占比例最大，這與前人的研究結(jié)果基本一致［25-26］。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，由于靶點(diǎn)2 插入單個(gè)堿基A/T/C 引發(fā)移碼，致使編碼肽鏈提前遇到終止密碼子，翻譯的氨基酸鏈大幅縮短。

本研究中T0轉(zhuǎn)化植株CPS2 表達(dá)量均顯著低于8306，說(shuō)明對(duì)目的基因定向編輯后，其基因表達(dá)量水平顯著降低，這與姚恒等［27］、宋凡等［28］、汪秉琨等［29］的研究結(jié)果一致。除此之外，ABS 的表達(dá)量也顯著降低，其冷杉醇和賴百當(dāng)烯二醇含量也顯著降低，說(shuō)明敲除CPS2 也會(huì)抑制ABS 基因的表達(dá)，引起賴百當(dāng)類物質(zhì)含量降低。T0轉(zhuǎn)化植株DXR 表達(dá)量均顯著升高，GGPP 含量也大幅提升，說(shuō)明敲除CPS2 并抑制賴百當(dāng)類物質(zhì)合成途徑后，促進(jìn)了上游途徑中萜類物質(zhì)合成前體GGPP 的積累。敲除CPS2 會(huì)抑制賴百當(dāng)類物質(zhì)合成，由于對(duì)共同底物GGPP 的競(jìng)爭(zhēng)減少，預(yù)測(cè)西柏烷類物質(zhì)含量可能會(huì)適度增加。然而，西柏三烯一醇含量變化并無(wú)規(guī)律性，西柏三烯二醇除1 株差異不顯著外其他均小幅降低。推測(cè)可能的原因是由于編輯技術(shù)上的差異，造成個(gè)體間西柏烷類物質(zhì)含量差異；或者敲除CPS2 可能在一定程度上抑制了二萜類合成酶活性，抑制西柏烷類和賴百當(dāng)類物質(zhì)合成，同時(shí)積累的GGPP 有可能向其他萜類合成途徑轉(zhuǎn)化。敲除CPS2 對(duì)植株農(nóng)藝性狀會(huì)產(chǎn)生影響，T0代轉(zhuǎn)化植株較未編輯8306 表現(xiàn)為株高、莖圍、葉間距、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬均顯著增加。這表明敲除CPS2 后使煙株的表型也發(fā)生了變化。

根據(jù)轉(zhuǎn)化植株測(cè)序峰型及其子代株系測(cè)序結(jié)果，獲得了1 株純合型和6 株雜合型突變體。這些突變體的遺傳后代群體可進(jìn)行后續(xù)表型和功能的驗(yàn)證。而有關(guān)純合型轉(zhuǎn)化株系的無(wú)標(biāo)記基因篩選以及在其自交后代中的穩(wěn)定遺傳和高香氣品種繁育應(yīng)用方面尚有待進(jìn)一步研究。鑒于Cas9 蛋白與gRNA 可能發(fā)生錯(cuò)配導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，以及CRISPR系統(tǒng)有可能對(duì)靶位點(diǎn)再次剪切導(dǎo)致新的突變，因而對(duì)于靶修飾位點(diǎn)的遺傳穩(wěn)定性還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)高香氣烤煙品系8306 中的CPS2 基因進(jìn)行敲除，得到7 株靶位點(diǎn)單堿基A/T/C 插入的轉(zhuǎn)化植株。①CPS2 及ABS 表達(dá)量顯著降低，其冷杉醇和賴百當(dāng)烯二醇含量也顯著降低，敲除CPS2 后可抑制賴百當(dāng)類化合物的合成。②DXR 表達(dá)量顯著升高，GGPP 含量也大幅提升，敲除CPS2 有助于上游途徑中萜類物質(zhì)合成前體GGPP 的積累。③CYC-1 和CYP71D16 表達(dá)量差異較大，西柏三烯二醇出現(xiàn)小幅降低，敲除CPS2可能抑制西柏三烯二醇積累。④T0代轉(zhuǎn)化植株的株高、莖圍、葉間距、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬均增加，敲除CPS2 會(huì)使植株表型性狀發(fā)生變化。