張 慧，李澤鋒，徐國云，金靜靜，王 晨，翟 妞，金立鋒，鄭慶霞，陳千思，劉萍萍，周會娜

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白（Al-activated malate transporter，ALMT）是一類普遍存在于植物中的且植物特有的膜蛋白，在植物有機酸的跨膜轉(zhuǎn)運中起著至關(guān)重要的作用。有機酸在植物的初級代謝中具有重要作用，并參與植物對環(huán)境的適應(yīng)性，如氣孔運動、鋁的耐受性、pH 的調(diào)節(jié)和脅迫響應(yīng)等［1-4］。ALMT 作為陰離子通道能夠釋放蘋果酸，在酸性土壤中這類蛋白能夠螯合有毒的Al3+，從而保護植物根系的生長和吸收能力［4］。最早在耐鋁小麥（ET8）根尖中分離得到了鋁誘導(dǎo)表達的一個ALMT1 基因（TaALMT1）［5］，是植物中克隆獲得的第一個鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運基因。ALMT 蛋白大多定位于膜上（如細胞質(zhì)膜、液泡膜等），其N 端通常包含多個跨膜結(jié)構(gòu)域，參與Al3+激活的蘋果酸的運輸，C 端則包含一個位于膜外的疏水區(qū)，該疏水區(qū)是維持運輸功能所必需，N 端的跨膜區(qū)和C 端的疏水區(qū)共同促進鋁脅迫下蘋果酸的運輸［6-7］。

目前研究最多的擬南芥基因組中已鑒定出14個ALMT 蛋白，進化分枝上可分為4 個亞組［8-11］。第一亞組的AtALMT1 參與了Al3+的耐受，其表達受吲哚-3-乙酸、脫落酸、過氧化氫等處理的誘導(dǎo)［9］。第二亞組的AtALMT6 和AtALMT9 定位在保衛(wèi)細胞的液泡膜上，與液泡中蘋果酸的含量相關(guān)，同時，AtALMT9 還是個氯離子通道蛋白［9-10］。第三亞組的AtALMT12 定位于保衛(wèi)細胞的質(zhì)膜上，與氣孔的關(guān)閉有關(guān)，電生理學(xué)研究表明該蛋白是個快速激活的陰離子通道。第四亞組AtALMT 蛋白的功能暫不明確。近年來，又有多個物種的ALMT 基因家族已被鑒定，如白楊基因組中含有22個ALMT基因［11］，水稻基因組中含有8 個ALMT 基因，中國白梨基因組中有27 個ALMT 基因［12］，蘋果基因組中有25 個ALMT 基因［13］，大豆基因組中有34 個ALMT 基因［14］等。但目前關(guān)于煙草ALMT 基因家族的研究未見報道。蘋果酸是煙草的一種重要有機酸，對于煙草生長發(fā)育及煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)等都有重要影響［15］。另外，作為一種離子通道蛋白，ALMT 家族個別成員也被發(fā)現(xiàn)參與氯離子的吸收轉(zhuǎn)運。為了探索煙草ALMT 家族成員是否參與了煙草氯離子的吸收轉(zhuǎn)運，本試驗采用鹽處理后檢測基因表達量的方法進行了初步篩選，并對煙草ALMT 基因家族進行了研究，旨在進一步了解煙草的重要功能基因并為實現(xiàn)煙草重要性狀的分子調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

普通栽培煙草紅花大金元（紅大）于2017 年種植在國家煙草基因研究中心的植物生長室，培養(yǎng)條件為溫度28 ℃、濕度70%～75%、光照16 h、黑暗8 h。采集盛花期煙株的根、莖和葉等，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。氯鹽（NaCl）處理的紅大煙苗也種植于植物生長室，樣品的處理和選取參照文獻［16］，即：待煙苗長至6 片真葉時，將根部用清水洗凈，植株移至1/2 MS 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，1周后向處理組培養(yǎng)液中加入NaCl 溶液至終濃度300 mmol/L，處理前、處理后3 d 及處理后7 d 分別選取根、莖和葉進行取樣，與對照樣品一起經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每個處理設(shè)置3個獨立重復(fù)，每個重復(fù)選擇3 株長勢一致的煙苗。

1.2 方法

1.2.1 煙草ALMT 基因鑒定

從TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥ALMT 蛋白序列，從中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫4.0中比對搜索普通煙草紅大的ALMT蛋白序列，并將其命名為NtALMT。利用ExPASy Proteomics Server（http：//expasy.org/）對NtALMT 氨基酸序列進行分子量、等電點的預(yù)測分析；利用TMHMN Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù) 測NtALMT 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.2 煙草ALMT 基因生物信息學(xué)分析

利用進化樹分析軟件MEGA7，采用NJ 法（參數(shù)：Poission correction、pairwise deletion 和1 000 次重復(fù)bootstrap），對NtALMT 蛋白序列進行進化樹分析，分別從TAIR 網(wǎng)站和Rice Genome Annotation Project（http：//eice.plantbiology.msu.edu/）網(wǎng) 站 下 載擬南芥ALMT 和水稻ALMT 蛋白序列，并對煙草、擬南芥和水稻的ALMT 蛋白進行進化樹分析，所得進化樹使用EvolView（http：//www.evolgenius.info/evolview/）網(wǎng)站進行優(yōu)化展示；利用MCScanX［17］對共線性基因進行鑒定；通過GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對NtALMT 基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行可視化展示；利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）對NtALMT 蛋 白 的 保 守motif 進行 分析，其中motif 的寬度在6～50 個氨基酸之間，且最大motif 數(shù)量為10。

1.2.3 煙草總RNA 提取及cDNA 制備

煙草總RNA 提取及cDNA 制備方法采用植物RNA 提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)有限公司）和Roche 第一鏈cDNA 合成試劑盒（美國Roche 公司）按照文獻［18］中的方法進行。

1.2.4 NtALMT 基因表達分析

根據(jù)中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，剔除在各組織、不同條件下均不表達的基因，其他NtALMT 基因用qPCR 技術(shù)分析其在不同組織及鹽脅迫下的相對表達量。設(shè)計qPCR引物（表1），采用煙草的26S rRNA 基因作為內(nèi)參，NtALMT 基因表達分析按照參考文獻［19］進行，每個樣品包括3次生物重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系為：10 μL 2×SYBR I Master，上下游引物各0.5 μL，50 ng 的cDNA，加ddH2O 至20 μL。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)循環(huán)閾值（CT值），用2-ΔΔCT方法計算NtALMT 基因的相對表達量。

表1 NtALMT 基因的qPCR 引物Tab.1 Primers of NtALMT genes for qPCR

1.2.5 氯離子含量測定

參照文獻［18］測定煙草根、莖和葉片氯離子含量（質(zhì)量分數(shù)）。在鹽處理前、鹽處理第3 天及鹽處理第7天，分別對煙草葉片和根部進行取樣，樣品放置于105 ℃烘箱烘干過夜，使用混合型振蕩研磨儀對其研磨至粉末狀，稱取約0.050 0 g（精確至0.1 mg）粉末，置于10 mL 5%（體積分數(shù)）醋酸中，30 ℃振蕩萃取30 min，然后用定性濾紙過濾，濾液經(jīng)稀釋后用連續(xù)流動分析儀測定氯離子含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 NtALMT 基因序列鑒定

利用擬南芥ALMT 蛋白序列在中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫4.0 中比對搜索普通煙草紅花大金元的ALMT 蛋白序列，得到30 個NtALMT 基因（表2），根據(jù)基因ID，依次命名為NtALMT1-NtALMT30。通過對這30 個基因的CDS 長度、基因組序列長度、氨基酸序列長度、等電點、分子量和跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量等的分析，結(jié)果表明NtALMT 基因長度在2.03～24.95 kb之間，CDS 長度在1.27～2.3 kb 之間，蛋白質(zhì)等電點在5.4～9.15 之間，蛋白分子量在46.3～84.9 kDa 之間，NtALMT 蛋白都具有4～6 個跨膜結(jié)構(gòu)域。

表2 NtALMT 基因序列特征Tab.2 Sequence characteristics of NtALMT genes

表2（續(xù)）

2.2 NtALMT 基因的染色體定位及共線性分析

利用Circos 軟件對NtALMT 基因進行了染色體定位，見圖1。由圖1 可見，30 個NtALMT 基因中只有22 個能夠定位在各染色體上，其余的8 個基因位于scaffold 上無法精確定位。其中，NtALMT18 和NtALMT26 定 位 在1 號 染 色 體 上，NtALMT12 和NtALMT8 定位在2 號染色體上，NtALMT11 定位在3號染色體上，NtALMT17 定位在4 號染色體上，NtALMT21 定 位 在6 號 染 色 體 上，NtALMT24 和NtALMT25 定 位 在7 號 染 色 體 上，NtALMT19 和NtALMT20 定 位 在8 號 染 色 體 上，NtALMT5 和NtALMT10 定 位 在10 號 染 色 體 上，NtALMT16 和NtALMT23 定位在11 號染色體上，NtALMT13 定位在12 號染色體上，NtALMT1 和NtALMT22 定位在14 號染色體上，NtALMT14 定位在18 號染色體上，NtALMT2 定 位 在19 號 染 色 體 上，NtALMT3 和NtALMT4 定位在21 號染色體上。

串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)是基因家族擴展的兩種主要機制［19］?；谖恢梅植技肮簿€性關(guān)系，NtALMT3/4、NtALMT18/26、NtALMT24/25、NtALMT19/20 可能發(fā)生了串聯(lián)復(fù)制，而共線性基因?qū)Γㄈ纾篘tALMT6/27、NtALMT12/21等）可能發(fā)生了片段復(fù)制。

2.3 NtALMT 蛋白的進化分析

首先使用MUSCLE 軟件對30 個NtALMT 的序列進行比對，接著用MEGA7 軟件中的鄰接法生成ALMT 蛋白家族的系統(tǒng)進化樹，見圖2。由圖2 中可見，NtALMT 蛋白家族的30 個成員可以分成5組。為了進一步明確NtALMT 進化分類，通過搜索數(shù)據(jù)庫獲得擬南芥ALMT（14 個）和水稻ALMT（8個）蛋白序列，將煙草、擬南芥、水稻ALMT 共52 條蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。與擬南芥ALMT 基因類似，30 個NtALMT 蛋白中除了NtALMT26 外其余的29 個NtALMT 蛋白可分為4 個分支（Clade 1、2、3 和5）。值得注意的是大多數(shù)NtALMT 都在Clade 1中。不同物種ALMT 蛋白之間的高度保守表明了煙草ALMT 可能與其他物種ALMT 蛋白具有相似的功能。

圖1 NtALMT 基因的染色體定位及共線性分析Fig.1 Chromosome location and synteny analysis of NtALMT genes

圖2 植物ALMT 蛋白家族的進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of ALMT protein family from different plants

2.4 NtALMT 基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)是描繪一個基因家族的重要特征，在基因家族的進化中起著重要的作用［20］。在30 個NtALMT 基因中大部分基因（21 個）結(jié)構(gòu)在進化過程中高度保守，都含有6 個外顯子和5 個內(nèi)含子，且各外顯子的長度也很保守，但內(nèi)含子長度變化多樣。

利用MEME軟件對30個NtALMT基因的保守Motif進行了分析，結(jié)果如圖3所示。共鑒定了10個分布在ALMT 蛋白上的保守Motif，其中，Motif 1、Motif 2、Motif 3在除NtALMT26外的其他基因中都存在。ALMT基因高度保守的WEP 基序（Trp-Glu-Pro）位于Motif 5 中。同時，NtALMT 基因還被Motif 2 中的WAG殘基分為N-端和C-端［21］。N-端由Motif 1、3、4、8 和10組成，包含5或6個跨膜結(jié)構(gòu)，是離子運輸通道并參與Al3+信號傳導(dǎo)，而C-端則包含Motif 2、5、6、7 和9，其作用是調(diào)節(jié)ALMT 基因?qū)l3+的響應(yīng)。

圖3 NtALMT 基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Structures and conserved motifs of NtALMT genes

2.5 NtALMT 基因的表達分析

根據(jù)中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中NtALMT轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，30 個NtALMT 基因有11 個在各組織、各時期均無表達，這11 個基因分別是NtALMT1-NtALMT5、NtALMT7-NtALMT8、NtALMT11、NtALMT15、NtALMT23和NtALMT25。利用qPCR 檢測其余19 個NtALMT 基因在栽培煙草根、莖和葉中的表達量（以根中基因表達量為1計算），只有14個基因在根莖葉中有表達（圖4），其余的5個基因（NtALMT13-NtALMT14、NtALMT16、NtALMT29-NtALMT30）在根莖葉中未檢測出表達。從圖4 中可以看出，14 個根莖葉中能檢測到的NtALMT基因大多數(shù)在莖中表達量較高，如NtALMT12、NtALMT19 和NtALMT24 分別在莖中表達量是根中的39 倍、18 倍、12 倍和10 倍。值得注意的是NtALMT28基因在葉片中的表達遠遠高于根部和莖部。在已經(jīng)報道的ALMT家族成員中，TaALMT1等基因主要在根部行使功能進而使植物適應(yīng)鋁毒［5］，煙草NtALMT 基因大多在莖中表達較高而在根部表達相對較低，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能跟Al3+的誘導(dǎo)有關(guān)，一些基因可能在Al3+離子的誘導(dǎo)下根部表達才會增加更多。

2.6 NtALMT 基因在鹽處理條件下的表達分析

圖4 NtALMT 基因在煙草不同組織中的表達分析Fig.4 Expression patterns of NtALMT genes in different tissues of tobacco

圖5 NaCl 處理后NtALMT 基因在根莖葉中表達量的變化Fig.5 Expression levels of NtALMT genes in roots,stalks and leaves after NaCl treatment

利用qPCR 的方法檢測上述NtALMT 基因在根、莖和葉中的表達變化情況，結(jié)果如圖5（A～C）所示。從根部數(shù)據(jù)來看，鹽處理7 d 后根部NtALMT24基因上調(diào)了3.6 倍；NtALMT21 基因在鹽處理3 d 時表達量上調(diào)了2.9 倍，但隨著時間推移表達量又有所下降。從莖部數(shù)據(jù)來看，NtALMT10 基因在鹽處理3 d 時表達上調(diào)8 倍以上，但到處理7 d 時表達量又下降至對照組的4 倍左右；NtALMT12 和NtALMT21 兩個基因在鹽處理7 d 時表達量分別上升 了4.5 和3.8 倍；此 外，NtALMT9、NtALMT17、NtALMT18、NtALMT19 和NtALMT27 等5 個基因在鹽處理后表達量明顯下調(diào)。從葉部數(shù)據(jù)來看，NtALMT19 在鹽處理7 d 時表達上調(diào)25 倍以上，NtALMT21 基因在鹽處理7 d 時表達量上調(diào)了近8倍。結(jié)合3 個部位的基因表達情況可以看到，氯鹽處理后，NtALMT12 基因在根莖葉中都表現(xiàn)出先降低后升高的表達模式，NtALMT21 和NtALMT24 在根莖葉中的表達量均有不同程度的上調(diào)，NtALMT27在根、莖和葉中的表達則受到不同程度的抑制。上述表達變化較大的基因中NtALMT10 與AtALMT9 在進化上相對較近、序列相似性較高，而AtALMT9 之前報道是一個氯離子通道，這也預(yù)示著NtALMT10可能有類似的功能?？傊@些結(jié)果表明，在高氯鹽處理后NtALMT 基因在各組織中有不同程度的表達變化，暗示了這些基因可能參與了鹽脅迫下氯離子的吸收轉(zhuǎn)運。而具體參與氯離子轉(zhuǎn)運的NtALMT基因及其機制還需進一步的試驗驗證。

根、莖和葉氯離子含量的測定結(jié)果如圖5（D～F）所示，根和葉中氯離子含量在鹽處理后顯著升高。在鹽處理3 d 時根部氯離子含量明顯高于葉部氯離子含量，當鹽處理7 d時根和葉中氯離子含量基本一致，說明此時根部氯離子向上運輸達到最大值。從圖5C 和圖5F 中可以看到AtALMT19 在鹽處理后葉片中的表達與氯離子含量變化一致，該基因是否參與煙草氯離子的吸收轉(zhuǎn)運仍有待進一步研究。

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法從普通煙草基因組中鑒定出30 個ALMT 基因家族成員，這些成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都相對保守，進化上與其他物種ALMT 家族基因類似，可分為5 個亞類。其中14 個NtALMT 基因在煙草根、莖和葉中均有表達，且在莖中的表達量較高，只有NtALMT28 基因在葉片中表達較高。氯鹽脅迫下NtALMT10 在莖中、NtALMT19在葉中表達顯著增加，暗示了其在鹽脅迫及氯離子吸收轉(zhuǎn)運中可能具有重要的作用。