胡燕梅，張 力，郭云貴，方中明，3

(1.江漢大學(xué) 期刊社，武漢 430056；2.武漢生物工程學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430415；3.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025)

銀杏(GinkgobilobaL.)屬裸子植物，是原產(chǎn)我國的古老孑遺植物，也是集藥用、食用、園林綠化、觀賞、材用、生態(tài)防護(hù)、科研及文化于一體的多功能樹種.近年來，隨著銀杏的不斷開發(fā)利用，特別是果用林和葉用林產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對銀杏苗木的需求也大大增加[1].但其傳統(tǒng)的播種育苗方法繁殖率低、周期長，不能滿足市場需求，而采取更高效快速的組織培養(yǎng)法對銀杏胚進(jìn)行離體培養(yǎng)使之快速成苗是有效可行的方法.但銀杏胚存在生理后熟，給銀杏的離體培養(yǎng)帶來困難[2-3].近年來我國學(xué)者對銀杏胚離體培養(yǎng)成苗雖開展了多項(xiàng)研究，但由于取材過程中存在品種不明確的問題，導(dǎo)致銀杏胚離體培養(yǎng)萌發(fā)成苗效果的差異較大[4-8].銀杏在世界的分布范圍十分廣泛，但由于選育目的不同和國際間交流較少等原因，目前銀杏品種命名和分類比較混亂.2011年南京林業(yè)大學(xué)曹福亮教授[9]提出將銀杏品種的分類體系根據(jù)培養(yǎng)目的不同分為核用、葉用、花粉用、觀賞用、材用五大類.本文針對湖北本土的銀杏品種，即核用品種中的中子品種系的‘安陸1號’開展了6種基本培養(yǎng)基及4種外源添加物對胚離體萌發(fā)成苗的試驗(yàn)，以期探索該品種銀杏胚離體萌發(fā)成苗的適宜因子，為銀杏種苗快速生產(chǎn)和種質(zhì)離體資源的保存提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與處理

當(dāng)年生新鮮銀杏種子來源于湖北省隨州地區(qū)，根據(jù)文獻(xiàn)[9]初步鑒定，該批銀杏種子為中子品系中的‘安陸1號’.銀杏種子去外種皮后陰干，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮，在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡30 s后用0.1%升汞消毒8 min，無菌水沖洗5遍，于無菌條件下切開胚乳仔細(xì)取出胚，接種在下述各種培養(yǎng)基中.每個處理接種20個胚，重復(fù)3次，于恒溫(25±2)℃下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 500～2 000 Lux,光照時間為10 h/d.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計及方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響 基本培養(yǎng)基分別為MS、B5、N6、SH、MK、6,7-V.每種培養(yǎng)基分別加入30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH=5.8±0.2.

1.2.2 椰子乳對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響 選取新鮮的椰子，倒出汁液煮沸后濾紙過濾得到濾液，以N6+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基(pH=5.8±0.2)，每升培養(yǎng)基分別加入50、100、150、200 mL椰子乳，以不加椰子乳為對照(CK).

1.2.3 活性炭對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響 每升N6+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂基本培養(yǎng)基(pH=5.8±0.2)分別加入1、2、3、4 g活性炭,以不加活性炭為對照(CK).滅菌后待瓊脂快凝固時搖動培養(yǎng)基使活性炭均勻懸浮,凝固后4℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.4 水解酪蛋白對銀杏幼胚萌發(fā)成苗的影響 每升N6+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂基本培養(yǎng)基(pH=5.8±0.2)分別加入0.2、0.5、1.0、2.0 g水解酪蛋白,以不加水解酪蛋白為對照(CK).

1.2.5 銀杏胚乳汁對銀杏幼胚萌發(fā)成苗的影響 選取新鮮的銀杏胚乳，用榨汁機(jī)破碎后四層紗布過濾得到胚乳汁液，每升N6+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂基本培養(yǎng)基(pH=5.8±0.2)分別加入5、10、50、100、150、200 mL，以不加胚乳汁為對照(CK).

1.3 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計

培養(yǎng)28 d后測量株高；統(tǒng)計有效接種數(shù)、萌發(fā)數(shù)和成苗數(shù)，計算萌發(fā)率和成苗率；數(shù)據(jù)記錄的同時對銀杏胚的成苗過程進(jìn)行拍照.

株高：直尺測量幼苗整體高度(cm)；有效接種數(shù)(Ne)：培養(yǎng)28 d后未污染的接種數(shù)；萌發(fā)數(shù)(Mn)：子葉展開，胚根長出，胚芽露出的幼胚數(shù)；成苗數(shù)(Cn)：胚根長出，胚芽長高，抽出真葉的幼胚數(shù).萌發(fā)率(M)和成苗率(C)用以下公式計算.

M=(Mn/Ne)×100%；C=(Cn/Ne)×100%.

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 18.0軟件中完全隨機(jī)單因素試驗(yàn)方差分析鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan’s multiple range test)評估各試驗(yàn)處理間差異顯著性.

表1 基本培養(yǎng)基對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響Tab.1 Effect of basic medium on ginkgo embryos of plantlet in vitro

注：同列數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響

銀杏胚接種培養(yǎng)3～5 d后其子葉均展開，持續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)子葉慢慢由淡黃色轉(zhuǎn)綠.5～7 d后觀察到胚芽與胚根有抽出跡象，同時有部分胚子葉發(fā)生卷曲、膨大，有愈傷化跡象.14 d后繼續(xù)觀察，有萌發(fā)跡象的幼胚的胚根逐漸長出，胚芽微露.28 d后部分幼苗胚芽抽出真葉，胚根繼續(xù)長深長粗，基本成苗(見圖1).統(tǒng)計萌發(fā)率、成苗率和株高見表1.

圖1 銀杏胚萌發(fā)成苗過程

Fig.1 Germination and seedling formation ofGinkgobilobaembryo in vitro

試驗(yàn)結(jié)果顯示基本培養(yǎng)基N6中胚萌發(fā)率達(dá)到85.7%，在同組試驗(yàn)中顯著性最高，其中36.7%萌發(fā)苗的胚芽抽出真葉，成為成型的幼苗.而其他5種基本培養(yǎng)基中胚均僅萌發(fā)而不能成苗，表明N6為本試驗(yàn)中‘安陸1號’銀杏胚萌發(fā)和成苗的最適基本培養(yǎng)基.

表2 椰子乳對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響Tab.2 Effect of coconut milk on ginkgo embryos of plantlet in vitro

表3 活性炭對胚萌發(fā)成苗的影響Tab.3 Effect of activated carbon on ginkgo embryos of plantlet in vitro

表4 水解酪蛋白對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響Tab.4 Effect of casein hydrolysate on ginkgo embryos of plantlet in vitro

表5 銀杏胚乳汁幼胚萌發(fā)成苗的影響Tab.5 Effect of embryo milk on ginkgo embryos of seedlings in vitro

2.2 椰子乳對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響

由表2可知，基本培養(yǎng)基N6中加入椰子乳后，萌發(fā)率整體不如CK，但椰子乳低體積分?jǐn)?shù)時成苗率有所增加.同時幼苗株高整體較對照組要好，株高最高可達(dá)到3.5 cm.即椰子乳加入培養(yǎng)基中雖不能提高萌發(fā)率，但加入量適當(dāng)時可提高成苗率，且能促進(jìn)幼苗長勢，尤其以100 ml/L的椰子乳處理最好.但考慮到工廠化育苗批量生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本及試驗(yàn)工序的繁瑣性，認(rèn)為椰子乳在‘安陸1號’銀杏胚離體成苗試驗(yàn)中可以不予添加.

2.3 活性炭對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響

由表3可知基本培養(yǎng)基中加入適量的活性炭可顯著性促進(jìn)銀杏胚的萌發(fā)和成苗，尤其以2 g/L的活性炭處理成苗效果最好，且幼苗株高達(dá)到3.7 cm，均與對照有顯著性區(qū)別，但該處理組幼苗較細(xì)長且瘦弱，長勢不如對照.表明活性炭加入培養(yǎng)基中雖可吸附一定的有害物，促進(jìn)幼胚萌發(fā)，但同時可能又吸附了培養(yǎng)基中胚生長發(fā)育的某種物質(zhì)，導(dǎo)致幼苗長勢較差.從幼苗長勢來看，建議‘安陸1號’銀杏胚離體成苗試驗(yàn)中可以不予添加活性炭.

2.4 水解酪蛋白對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響

由表4可知水解酪蛋白的4個處理較對照組的萌發(fā)率、成苗率和平均株高3個指標(biāo)均有顯著性促進(jìn)作用，但隨著其加入量的上升，胚萌發(fā)率和成苗率呈先升后降的趨勢.其中0.5 g/L和1.0 g/L處理組萌發(fā)率達(dá)到100%，1.0 g/L處理成苗率也達(dá)到100%，而0.5 g/L處理幼苗成苗率也達(dá)到92.8%，且其幼苗長勢卻明顯優(yōu)于1.0 g/L處理，其幼苗長勢最粗壯.綜合考慮認(rèn)為0.5 g/L的水解酪蛋白加入培養(yǎng)基中最適合‘安陸1號’銀杏胚萌發(fā)成苗，也建議后期生產(chǎn)中考慮加入水解酪蛋白.

2.5 胚乳汁對銀杏胚萌發(fā)成苗的影響

由表5可知當(dāng)銀杏胚乳汁達(dá)到100 mL/L時萌發(fā)率快速降低，且成苗率為0，表明胚乳汁加入量過高時不利于胚成苗.但適當(dāng)?shù)图尤肓康呐呷橹瓍s可以顯著促進(jìn)胚的萌發(fā)和成苗，尤其是當(dāng)胚乳汁為10 mL/L時萌發(fā)率及成苗率均較理想，且幼苗長勢粗壯，有利于‘安陸1號’銀杏胚的成苗.考慮到銀杏胚乳的價格及取材的復(fù)雜性，建議工業(yè)化批量生產(chǎn)中不宜添加，但在優(yōu)質(zhì)種苗的保存與培育過程中可適量加入.

3 結(jié)論與討論

‘安陸1號’為湖北省隨州地區(qū)銀杏中子品系中的典型代表品種，本試驗(yàn)以此為研究對象，探討了基本培養(yǎng)基及幾種添加物對該品種胚離體萌發(fā)成苗的影響.試驗(yàn)結(jié)果表明：6種基本培養(yǎng)基中N6最適于銀杏胚的萌發(fā)及成苗，4種添加物在適宜添加量下均能有效促進(jìn)胚的萌發(fā)及成苗，其中100 mL/L椰子乳促進(jìn)銀杏胚萌發(fā)率和成苗率分別提高到66.7%和40.1%，2 g/L活性炭促進(jìn)銀杏胚萌發(fā)率和成苗率分別提高到86.7%和46.2%，0.5 g/L水解酪蛋白處理可提高到100%和92.8%,10 mL/L銀杏胚乳汁促進(jìn)銀杏胚萌發(fā)率和成苗率分別提高到92.8%和71.4%.但由于實(shí)際種苗生產(chǎn)過程中規(guī)模較大，考慮到培養(yǎng)基配制工藝的繁瑣及生產(chǎn)成本增加，且綜合考慮幾種添加物的實(shí)際促進(jìn)效果，建議銀杏離體培養(yǎng)過程中以添加水解酪蛋白為主.

普遍認(rèn)為銀杏胚的生理后熟給銀杏的離體培養(yǎng)帶來困難.Holt[10]認(rèn)為銀杏種子從母體脫離后即有發(fā)育完好的胚，外層的漿種皮是銀杏種子冬季休眠的原因，其存在顯著降低了整體萌發(fā)率.陳穎等[11]研究表明銀杏的種胚存在生理后熟現(xiàn)象，大子葉胚(3.0～5.0 mm)和小子葉胚(1.0～3.0 mm)接種在不同的培養(yǎng)基上后發(fā)現(xiàn)大子葉胚愈傷化程度小，而小子葉胚全部愈傷化，繼續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)芽點(diǎn).郭長祿等[7]研究報道大于3 mm的胚更容易成功誘導(dǎo)出胚狀體從而得到組培苗.在本試驗(yàn)的前期探索性預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)若胚在1 mm左右則無法形成愈傷組織或苗，直接枯死；胚在2 mm左右則易于形成愈傷組織，不易成苗；3 mm左右的胚則易于成苗.

N6培養(yǎng)基是1974年我國學(xué)者朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計[12],但本試驗(yàn)結(jié)果得出N6也適合裸子科植物銀杏胚的培養(yǎng)，是否意味著單子葉植物和裸子植物之間對營養(yǎng)的需求有相似之處，進(jìn)而在親緣關(guān)系上是否更近一層，值得深入研究.羅言云等[6]表明6,7-V培養(yǎng)基適宜銀杏幼胚萌發(fā)，其胚成苗率達(dá)到100%，這可能與銀杏種子來源不一致有關(guān)；同時認(rèn)為添加0.1 mg/L的NAA有助于苗的生長，但在本試驗(yàn)的前期探索中，6種基本培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L NAA時成苗率均極低，且容易產(chǎn)生大量的愈傷組織而抑制了幼苗的萌發(fā).陳穎等[13]認(rèn)為其供試的5個銀杏品種在DCR培養(yǎng)基中均有較高的萌發(fā)率，且幼苗長勢較好，在本試驗(yàn)中沒有使用此培養(yǎng)基，但一致都認(rèn)為B5不適宜銀杏幼胚的生長.單超[14]研究結(jié)果表明銀杏成熟胚誘導(dǎo)在MS基本培養(yǎng)基的萌發(fā)率為41.38%，高于本試驗(yàn)的MS培養(yǎng)基效果，但遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)的N6培養(yǎng)基.

水解酪蛋白是多種氨基酸的混合物，對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，也有相關(guān)試驗(yàn)證明水解酪蛋白對其他植物的離體培養(yǎng)有較好的促進(jìn)作用[15-16].本試驗(yàn)的4種添加劑中水解酪蛋白的效果最好，對銀杏胚的成苗有顯著促進(jìn)作用，胚的生長速度明顯加快，當(dāng)其添加量在1 g/L時幼胚萌發(fā)率與成苗率均較高，與羅言云的試驗(yàn)結(jié)果相同[6]，但本試驗(yàn)中0.5 g/L水解酪蛋白處理組的銀杏幼苗長勢卻更好.已有試驗(yàn)證明椰子乳可以很大程度上促進(jìn)銀杏幼胚的成苗[4]，郭長祿等[7]也證明在MK培養(yǎng)基中加入100 mL/L椰子乳時對胚狀體的生長發(fā)育有很好的促進(jìn)作用，胚狀體的成苗率達(dá)到34.5%.胡燕梅等[17]報道100 mL/L椰乳能促進(jìn)銀杏子葉愈傷組織生物量的提高.本實(shí)驗(yàn)向N6培養(yǎng)基中加入同樣量的椰子乳，其成苗率達(dá)到了40.1%，說明椰子乳可以促進(jìn)銀杏組織培養(yǎng)過程中的多種無性系材料的生長發(fā)育.趙海紅等[18]試驗(yàn)結(jié)果表明活性炭的加入可顯著促進(jìn)馬鈴薯脫毒試管苗的根莖葉的發(fā)育與生長，但活性炭的存在也導(dǎo)致試管苗植株的生長勢較弱，與本文結(jié)果相似.

馮景等[19]探討了自然界中銀杏種子發(fā)育的全過程中胚乳內(nèi)含物質(zhì)可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)等的動態(tài)變化規(guī)律，結(jié)果表明在后期胚發(fā)育中胚乳內(nèi)含物淀粉處于不斷累積和被利用，即胚乳參與了胚胎發(fā)育的代謝過程，為胚的成熟提供了營養(yǎng)物質(zhì).方詩雯[20]也報道胚乳內(nèi)含物參與了銀杏種子的后熟過程.胡燕梅等[17]報道在離體培養(yǎng)中銀杏胚乳汁能促進(jìn)銀杏子葉愈傷組織生物量的提高.姜蓓等[21]報道在添加3%胚乳汁的WPM培養(yǎng)基條件下，無菌苗的發(fā)芽率及生根率都保持在90%以上.本試驗(yàn)報道的10 mL/L的胚乳汁加入N6培養(yǎng)基中，萌發(fā)率及成苗率均顯著高于對照，但成苗率僅為71.4%，有可能是基本培養(yǎng)基或品種不同所致.