謝靜雯 - 楊錫洪,2 -,2 車紅霞,2 -,2 張景禹 -郁東興 - 解萬翠,2, -,2,

(1. 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042；2. 山東省生物化學(xué)工程重點實驗室，山東 青島 266042；3. 青島智科檢驗檢測有限公司，山東 青島 266002；4. 尚好科技有限公司，山東 青島 266002)

海洋頭足類有500多種，如墨魚、魷魚等，是食品加工的豐富來源。目前以捕撈為主，中國已成功培育曼氏無針烏賊(SepiellamaindronideRochebrune)幼苗[1]，有望實現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖。頭足類加工方式主要為冷凍冷藏、干制、復(fù)合調(diào)理食品等，加工過程中需棄除內(nèi)臟、墨囊等，產(chǎn)生大量副產(chǎn)物。如烏賊墨囊汁約為其體種的1.28%[2]，頭足類墨囊汁成分復(fù)雜，含有墨黑色素、多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分等多種物質(zhì)[3]，其中蛋白質(zhì)、多糖都具有良好的生物活性。

墨黑色素是一種多聚體顆粒，化學(xué)特性表現(xiàn)為耐酸、不溶于水，不溶于丙醇、丁醇和氯仿等大多數(shù)有機溶劑，可溶于堿性溶液和部分鹽溶液[3]。黑色素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，組成成分和理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)[4]，黑色素與蛋白質(zhì)、糖類等牢固地結(jié)合在一起，很難分離純化，且元素分析測定表明其富含鈣、鐵、鎂、鋅等金屬。

Nicolaus等[5]利用濃鹽酸水解分離純化墨魚黑色素，經(jīng)分析推測黑色素含有吲哚單元，并證實了羧基的存在。José等[6]分析了黑色素的組成，認為光吸收特性是由其吲哚共軛結(jié)構(gòu)決定，光保護作用和防輻射效應(yīng)也是黑色素生物活性研究的前沿和基礎(chǔ)。近年來，墨黑色素的天然活性作用備受關(guān)注，Chen等[7]利用蛋白酶水解黑色素，嘗試開發(fā)一種經(jīng)濟高效的分離方法，但其高純度樣品的制備工藝尚不成熟，黑色素完善的結(jié)構(gòu)模型也尚未建立。Araújo等[8]對于黑色素在腸道和結(jié)腸內(nèi)的pH靶向治療進行了初探，發(fā)現(xiàn)了黑色素在制藥和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛能，但具體的作用機制尚未明確。

文章擬通過闡述墨黑色素提取、結(jié)構(gòu)和生物活性的研究現(xiàn)狀，探討墨黑色素的高值化利用途徑，以期為墨黑色素的深入探索和資源開發(fā)提供參考。

1 墨黑色素提取純化及結(jié)構(gòu)解析

在墨囊中，墨黑色素顆粒中含有蛋白、多糖等分子，其雜聚性、難溶性等特點給墨黑色素的分離純化帶來了難題。制備純度較高、結(jié)構(gòu)完整的墨黑色素樣品，是進一步研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要前提，因此，優(yōu)化提取工藝、完善制備流程是墨黑色素的重要研究方向。

1.1 頭足類海洋動物中墨黑色素的形成

墨黑色素在頭足類動物的墨囊中，底部的墨腺是黑色素的合成工廠，黑色素在囊泡內(nèi)不斷積累，通過胞吐排出細胞外后，黑色素游離于細胞間隙形成墨汁顆粒。烏賊體內(nèi)黑色素的生物合成如圖1所示[9]。

酪氨酸經(jīng)過酪氨酸酶催化生成多巴，進一步氧化生成多巴醌，通過聚化反應(yīng)合成多巴色素[10]。在異構(gòu)酶的作用下，多巴色素脫羧、羥化為5,6-二羥基吲哚(5,6- dihydroxyindole，DHI)和二羥吲哚羧酸(dihydroxyindole carboxylic acid，DHICA)，經(jīng)過酶的催化氧化形成黑色素前體[11]。頭足類動物墨腺的特異性過氧化酶催化DHI和DHICA單體聚合成墨黑色素。

1.2 墨黑色素的分離、提取及純化

海洋頭足類動物的墨汁是一種混合懸濁液，其中的黑色素與蛋白、多糖等呈結(jié)合態(tài)，不溶于水，是游離存在的球狀小顆粒。目前主要通過水洗離心、酸/堿水解、堿溶酸沉、酶水解、超聲波處理等方式，去除墨汁中的蛋白、多糖和脂類等雜質(zhì)，制備墨黑色素。

圖1 黑色素在生物體內(nèi)生成過程[9]Figure 1 The process of melanin production in the body

通過重復(fù)洗滌可以去除水溶性雜質(zhì)，Liu等[12]將墨汁多次水洗離心，沉淀真空冷凍干燥，分離出黑色素粗樣品，但與黑色素結(jié)合的蛋白等不溶性雜質(zhì)未能去除。高濃度酸堿可精制純度較高的黑色素，Varga等[13]從酸性水解開始，去除碳水化合物和蛋白質(zhì)，用有機溶劑洗滌去除脂質(zhì)，最后經(jīng)過多次離心除去酚類化合物。堿溶酸沉法是目前應(yīng)用較多的制備方式，劉顯威等[14]以提取率為目標，確定最佳堿提液料比17∶1 (mL/g)、酸沉pH值1.85，此條件下墨黑色素提取率約16.69%。而不同的水解方式會導(dǎo)致黑色素成分和形態(tài)改變，且酸和堿濃度的增加也影響提純效率，污染生態(tài)環(huán)境。Liu等[15]探討了墨黑色素分離純化的不同干燥方法，結(jié)果顯示噴霧干燥會引起聚集從而減少表面積，而超臨界干燥使得產(chǎn)生的黑色素表面粗糙，表明干燥方式對黑色素的形貌也有較大影響。

酶解條件溫和，不破壞黑色素形態(tài)，是較理想的純化方式。何健等[16]選用水解能力最強的酸性蛋白酶，得到最佳酶解條件為pH 3.5、溫度50 ℃、酶解2 h、加酶量3.0%，此條件下烏賊墨水解度11.45%。從產(chǎn)業(yè)化角度出發(fā)，以產(chǎn)出率為導(dǎo)向，高然等[17]確定堿性蛋白酶為最適酶，在pH 10.40，酶解溫度65 ℃，加酶量2.60%，酶解時間2.45 h的條件下，魷魚黑色素得率(83.89±0.21)%。超聲降解可增加水溶性，利于理化分析和活性檢測。袁麗等[18]利用超聲破碎黑色素，生成更小的聚集單元，對其特征結(jié)構(gòu)DHI沒有顯著影響，降解效果良好，也利于工業(yè)化生產(chǎn)。

墨黑色素不溶于大多數(shù)液體介質(zhì)，限制了其應(yīng)用發(fā)展。酸堿水解反應(yīng)劇烈，破壞黑色素，而高速離心法則只能去除水溶性雜質(zhì)。酶法較溫和，能有效去除與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)、脂類和多糖。采取幾種方法相結(jié)合的提取工藝，可實現(xiàn)優(yōu)勢互補。Guo等[19]采用超聲波輔助降解法，在堿性條件下制備了水溶性魷魚黑色素組分，試驗結(jié)果顯示，黑色素基本結(jié)構(gòu)保持不變，且具有良好的溶解性。

墨汁中成分復(fù)雜，目前常用的提取流程見圖2。不同分離純化方法獲得的黑色素樣品的純度、形態(tài)、粒徑大小等均有所不同[20]。

1.3 墨黑色素的結(jié)構(gòu)特點及鑒定

Piattelli等[21]通過甲基取代的方式，研究黑色素的化學(xué)組成，利用堿降解證實黑色素是以二羥吲哚為單元的聚合物。紅外光譜表明，墨黑色素是一種高度交聯(lián)和不規(guī)則的聚合物，由兩種基本單位DHI和DHICA及其衍生物為結(jié)構(gòu)元件組成，單體結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖2 提取工藝流程圖Figure 2 The extraction process flow chart

根據(jù)黑色素分子結(jié)構(gòu)，紫外和可見光光譜顯示，其包含酚羥基(OH-)、羧基(COOH-)和氨基(NH+)基團作為金屬離子的潛在結(jié)合位點，研究[11]發(fā)現(xiàn)，黑色素是DHI和DHICA單體組成的共聚物。Magarelli等[22]通過高效液相色譜定量分析，認為黑色素由20% DHI和75% DHICA組成。而后有報道[23]提出DHI∶DHICA約為5∶1，但酶促合成與5∶1的比例不完全匹配，據(jù)推測[24]，可能由于銅、鋅等金屬會促進多巴色素重排為DHICA。

Duchon[25]提出頭足類動物墨囊中的“黑素體”是球形且均勻的，直徑150～250 nm。Schraermeyer[26]認為其應(yīng)稱為黑色素顆粒，而不是黑素體。Chedekel等[27]提出分離純化黑色素的方法，從掃描電子顯微鏡(SEM)發(fā)現(xiàn)，墨黑色素以初級粒子混合物和多毫米級聚集體存在，具有多孔性，平均直徑159.530 nm。Longuet-Higgins[28]研究了黑色素的二級結(jié)構(gòu)雜聚模型，推斷單體間是隨機結(jié)合，該理論逐漸得到更多研究的認可和支持。結(jié)構(gòu)研究[29]揭示了墨黑色素由許多不超過5個或6個的吲哚單體平面堆疊而成，單體高度聚合，單元間通過橫向和縱向相互連接，聚合度不均一。

圖3 DHICA和DHI的結(jié)構(gòu)式[22]Figure 3 The structural formulas of DHICA and DHI

2 墨黑色素的生物活性

墨黑色素由吲哚單體聚合而成，能夠吸收紫外和可見光，是一種天然的內(nèi)源性功能物質(zhì)，能夠保護生物體免受輻射傷害，還能顯著清除自由基，在體內(nèi)外都具有陽離子吸附性。其生物活性與其組成和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，諸多研究通過體內(nèi)外的細胞和模型試驗，取得了初步的成果(表1)。

表1 部分黑色素生物活性研究結(jié)果Table1 Some melanin biological activity research results

墨黑色素的生物活性具有多樣性，其中最具有代表性特征的是抗氧化、金屬螯合、抗腫瘤和防輻射等功能，逐漸成為黑色素活性研究的熱點和趨勢。其具體的作用機制也得到了廣泛的關(guān)注，仍需要進一步的研究。

2.1 抗氧化

自由基是人體細胞正常代謝的產(chǎn)物，它與生物體的氧化、衰老和損傷等密切相關(guān)。正常組織中，抗氧化系統(tǒng)處在平衡狀態(tài)，墨黑色素可介導(dǎo)自由基信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[37]，進而對抗氧化酶進行了反饋調(diào)節(jié)。Sichel等[38]研究了黑色素和超氧化物歧化酶(SOD)活性對超氧陰離子的清除作用，結(jié)果表明黑色素的抗氧化活性可以部分模擬SOD的功能。Zou等[39]研究發(fā)現(xiàn)，黑色素對DPPH自由基、超氧自由基和羥基自由基均表現(xiàn)了較強的活性，半抑制濃度IC50值分別為0.18，0.59，0.34 mg/mL，且清除能力隨黑色素濃度增加而增加，清除效果顯著高于商品抗氧化劑。周月越等[40]研究表明，墨黑色素能抑制脂質(zhì)過氧化、減輕抗氧化酶的抑制、有效拮抗大腦神經(jīng)元的氧化損傷。除此之外，趙云等[41]根據(jù)糖基化衰老學(xué)說，驗證了墨黑色素對小鼠心臟抗衰老的能力，并發(fā)現(xiàn)衰老產(chǎn)物清除效果與黑色素劑量呈正比。

2.2 螯合金屬離子

Zdybel等[42]將共振光譜應(yīng)用于黑色素與金屬離子的相互作用，測定了不同濃度黑色素—鎘復(fù)合物的性質(zhì)，結(jié)果表明絡(luò)合物的形成與鎘的濃度有相關(guān)性。袁翊朦等[43]通過電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，魷魚墨黑色素在吸附了金屬離子之后，其球形顆粒相互聚集，形成了大量聚合物。Lian等[44]研究了Mg2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+等金屬離子和黑色素的—COOH、—NH2和—OH等官能團的相互作用，離子的結(jié)合可通過紅外吸收光譜法檢測。Lei等[45]研究表明，墨黑色素鐵可有效改善IDA大鼠的貧血癥狀，促進骨髓紅系造血，減輕貧血程度。Szpoganicz等[46]發(fā)現(xiàn)，不同pH條件下黑色素溶液中對苯二酚和苯醌兩種基團分別主導(dǎo)著金屬離子螯合的過程。

2.3 抗腫瘤

腫瘤的產(chǎn)生是細胞異常增殖的結(jié)果，抗腫瘤的關(guān)鍵在于對腫瘤細胞遷移和增殖的抑制。江凱等[47]以人肺腺癌細胞系A(chǔ)549為對象，通過體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)魷魚墨黑色素對腫瘤增殖具有較好的抑制作用，隨時間的延長，腫瘤抑制效果增加明顯(48 h時IC50為0.747 mg/mL，作用72 h時IC50為0.396 mg/mL)。劉亮等[48]通過MTT法和劃痕試驗，檢測了5種常見的腫瘤細胞，證明墨黑色素對腫瘤細胞的增殖有濃度依賴性抑制作用，并抑制腫瘤細胞的非定向遷移。蘇偉明等[49]采用超聲波處理、低溫離心、過濾等方法制備槍烏賊的墨汁提取物，對腫瘤細胞進行體外培養(yǎng)，對小鼠體內(nèi)移植性肉瘤和肝癌進行腹腔注射和灌胃，結(jié)果均顯示了墨黑色素顯著的抑制效果，且不影響動物體重，可在此基礎(chǔ)上進一步探索墨黑色素的抗腫瘤功效和機理。

2.4 防輻射

光吸收是黑色素多聚物最顯著的特性，由高度共軛結(jié)構(gòu)引發(fā)，可抵擋機體的光輻射。Ye等[50]發(fā)現(xiàn)紫外照射下黑色素可顯著提高大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的存活率，連續(xù)4周紫外線暴露測試也表明，黑色素小鼠試驗組皮膚未見曬傷，抗氧化酶體系活性顯著升高，提示黑色素具有較強的抗輻射作用。從輻射中產(chǎn)生的活性氧會引起機體光損傷，Dontsov等[51]檢測了紫外線誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，通過測定自由基和氧化產(chǎn)物的水平，證實了黑色素不僅阻滯了光和熱的灼傷，也啟動了內(nèi)源酶防御和抗氧化應(yīng)激。

3 高值化應(yīng)用研究趨勢

根據(jù)墨黑色素抗輻射、螯合金屬等活性特點，可進行新型生物活性配料及產(chǎn)品的研發(fā)，為天然生物活性分子的高效改良和應(yīng)用帶來了新的思路和理論基礎(chǔ)。

3.1 吸附劑、補鐵劑

可利用黑色素的吸附性進行重金屬脫除，也可以與鐵等元素螯合，制成補充劑。不僅可作為體內(nèi)重金屬的天然解毒劑，還可作為著色劑添加于食品中，或研發(fā)成為陽離子吸附劑。與無機鐵劑相比，黑色素鐵效果更顯著[52]，易于機體吸收，提高鐵的生物利用度，可開發(fā)安全有效、新型天然的鐵強化劑。

3.2 防輻射制品

黑色素能保護生物免受輻射損傷，具有優(yōu)越的防護功能。目前，對于蘇云金芽胞桿菌生物殺蟲劑的紫外防護上，黑色素已經(jīng)取得了顯著成效，減少光損傷，延長殺蟲時效[53]。除此之外，還可利用黑色素制成保護材料或生物制劑涂層等，對于不耐光或輻照的產(chǎn)品起到防護作用。

3.3 免疫制劑

黑色素可發(fā)展成為一種有效的陽性免疫調(diào)節(jié)劑，增強特異性和非特異性免疫，促進細胞增殖和活化，在醫(yī)療領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。黑色素可以提高體液免疫和細胞免疫，通過提升血清溶血素水平來促進抗體形成[54]，在此基礎(chǔ)上可進行免疫保健品的開發(fā)，或免疫藥物的研制。

深度開發(fā)墨黑色素的高值化利用途徑，如特醫(yī)食品、軍需食品、護膚品、保健用品、新型藥物等，充分發(fā)揮生物活性作用價值，具有巨大的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益。

4 結(jié)論及展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，可進一步分析墨黑色素的結(jié)構(gòu)組成和理化特征，同時借助先進儀器，探究墨黑色素的構(gòu)效關(guān)系和生物活性功能。① 墨黑色素難以分離純化，提取工藝有待改良，可研究超聲破碎、多重酶聯(lián)反應(yīng)、有機溶劑等協(xié)同分離方法，或借鑒超臨界、微波、微濾膜、大孔樹脂交換等新型提純技術(shù)。② 墨黑色素在生物體內(nèi)如何吸收利用和轉(zhuǎn)化，抗病毒、抗腫瘤等活性如何發(fā)揮效應(yīng)尚不明確。下一步有關(guān)生物活性研究應(yīng)聚焦于具體的作用機制和靶點，從分子水平上探索其功能作用機理。③ 墨黑色素是否有其他層面的生物活性，未探索過的臟器、疾病、血液及其他生理生化途徑是否存在顯著作用，如腸道調(diào)節(jié)、腦功能、止血凝血等值得進一步研究。