陳敬鑫 - 姜 琦,4 ,4 米紅波, -, 勵建榮 - 馬永鈞 -

(1. 渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2. 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；3. 國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧 錦州 121013；4. 海洋食品精深加工關鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；5. 浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316120)

魚油富含二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等多種多不飽和脂肪酸(PUFAs)，具有降血壓、降血脂、預防心腦血管疾病、延緩衰老等生理功能[1-2]。然而，魚油高度不飽和性使其在貯藏過程中對光、熱和氧氣都非常敏感，極易發(fā)生氧化酸敗，降低其營養(yǎng)價值[3]。因此，選擇合適的穩(wěn)態(tài)化技術(shù)，有效保護魚油的生理活性并擴大其應用范圍，是開發(fā)魚油產(chǎn)品亟待解決的問題之一。微膠囊技術(shù)可將富含多不飽和脂肪酸的魚油包裹起來，在魚油周圍形成由壁材組成的保護層，不僅能有效保護魚油，減少外界環(huán)境的破壞，延長產(chǎn)品貨架期；而且能改變魚油固有的物理形態(tài)，增加魚油的流動性和分散性，使其更廣泛地應用于食品中[4-6]。

目前，最常用的微膠囊技術(shù)是將微細乳化的芯材均勻、穩(wěn)定地混懸于已液化的壁材中形成乳狀液，再經(jīng)噴霧干燥制成微膠囊粉末。其中，穩(wěn)定的乳狀液體系是制備高質(zhì)量微膠囊粉末的前提。傳統(tǒng)的乳狀液包括單層的水包油型(O/W)、油包水型(W/O)和雙重的油包水包油型(O/W/O)。其中，單層乳狀液的物理穩(wěn)定性低，在極端pH、高離子強度、加熱、冷卻等條件下容易發(fā)生破乳現(xiàn)象[7]。Liao等[8]以脫酰胺的小麥面筋蛋白為壁材，制備O/W/O型雙重魚油乳狀液，可大大改善魚油的貯藏穩(wěn)定性和釋放性能。近年來，層層自組裝技術(shù)在食品領域得到了快速的發(fā)展，通過靜電吸附作用將兩種帶相反電荷的聚合電解質(zhì)交替沉積在油滴周圍可制成多層乳狀液，將多層乳狀液經(jīng)噴霧干燥后得到魚油微膠囊，可成功地控制其對氧化的敏感性，而且在魚油貯藏過程中，多層微膠囊更加有效地抑制其氧化[9-10]。

褐藻多糖是一種含有硫酸酯的水溶性陰離子多糖，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等生物活性[11-12]。馬尾藻褐藻多糖粗提物可清除DPPH自由基、ABTS自由基、螯合金屬離子等[13]。褐藻多糖和殼聚糖自組裝成納米粒子可降低細胞內(nèi)活性氧濃度和超氧陰離子自由基含量[14]。此外，Chang等[15]研究報道褐藻多糖和酪蛋白可通過靜電沉積作用包埋魚油液滴，防止魚油乳狀液絮凝，從而提高其穩(wěn)定性。明膠是通過膠原蛋白的部分水解和變性獲得的蛋白混合物，由于瘋牛病和宗教的原因，傳統(tǒng)哺乳動物明膠的使用被一些國家限制[16]。而魚類明膠作為一種潛在的哺乳動物明膠替代品，近年來受到了廣泛的關注。目前，魚骨明膠的提取和應用研究的報道還相對較少。

試驗擬以魚油為芯材，魚骨明膠和褐藻多糖為壁材，利用層層自組裝技術(shù)制備魚油乳狀液，通過噴霧干燥法制得多層魚油微膠囊，采用單因素試驗和正交試驗確定最優(yōu)工藝，并研究其在貯藏過程中的氧化穩(wěn)定性，旨在為其在食品中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚油：陜西森弗天然制品有限公司；

褐藻多糖：陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；

魚骨明膠：實驗室利用酶法提取所得；

冰乙酸、乙醇、石油醚、碘化鉀、三氯甲烷、硫代硫酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子分析天平：MS104TS型，梅特勒—托利多儀器公司；

pH計：PHS-25型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

高速分散均質(zhì)機：FJ-200型，上海標本模型廠；

實驗室噴霧干燥機：YC-1800型，上海雅程儀器設備有限公司；

Zeta電位分析儀：90Plus型，美國布魯克海文儀器公司；

超聲波清洗器：KQ-400B型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚油初級乳狀液的制備 將魚油和不同濃度的魚骨明膠溶液(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L)按體積比1∶9混合，調(diào)節(jié)pH至4.0，20 ℃下超聲10 min，利用高速分散均質(zhì)機5 000 r/min均質(zhì)4 min，制備魚油初級乳狀液，得到Zeta電位。

1.3.2 魚油二級乳狀液的制備 將魚油初級乳液和不同濃度的褐藻多糖溶液(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L)按體積比1∶1混合，調(diào)節(jié)pH至4.0，20 ℃下超聲10 min，利用高速分散均質(zhì)機5 000 r/min均質(zhì)4 min，制備魚油二級乳狀液，得到Zeta電位。

1.3.3 魚油三級乳狀液的制備 將魚油二級乳液和不同濃度的魚骨明膠溶液(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L)按體積比1∶1混合，調(diào)節(jié)pH至4.0，20 ℃下超聲10 min，利用高速分散均質(zhì)機5 000 r/min均質(zhì)4 min，制備魚油三級乳狀液，得到Zeta電位。

1.3.4 Zeta電位的測定 取少量魚油乳狀液用去離子水稀釋1 000倍，調(diào)節(jié)pH至4.0，用Zeta電位儀測定其電位，測試溫度25 ℃，平行測定3次。

1.3.5 魚油微膠囊制備的單因素試驗

(1) 超聲時間的確定：按照步驟1.3.1、1.3.2、1.3.3制備魚油三級乳狀液，其中初級乳狀液中魚骨明膠濃度1.5 g/L，二級乳狀液中褐藻多糖濃度1.0 g/L，三級乳狀液中魚骨明膠濃度2.5 g/L，超聲溫度30 ℃，超聲時間分別為10，15，20，25，30 min，均質(zhì)時間4 min，均質(zhì)速率5 000 r/min。利用噴霧干燥機進行噴霧干燥，進料溫度140 ℃，進料速度11 mL/min，測其包埋率。

(2) 超聲溫度的確定：按照步驟1.3.1、1.3.2、1.3.3制備魚油三級乳狀液，其中初級乳狀液中魚骨明膠濃度1.5 g/L，二級乳狀液中褐藻多糖濃度1.0 g/L，三級乳狀液中魚骨明膠濃度2.5 g/L，超聲溫度分別為20，25，30，35，40 ℃，超聲時間15 min，均質(zhì)時間4 min，均質(zhì)速率5 000 r/min。利用噴霧干燥機進行噴霧干燥，進料溫度140 ℃，進料速度11 mL/min，測其包埋率。

(3) 均質(zhì)時間的確定：按照步驟1.3.1、1.3.2、1.3.3制備魚油三級乳狀液，其中初級乳狀液中魚骨明膠濃度1.5 g/L，二級乳狀液中褐藻多糖濃度1.0 g/L，三級乳狀液中魚骨明膠濃度2.5 g/L，超聲溫度30 ℃，超聲時間15 min，均質(zhì)時間分別為2，4，6，8，10 min，均質(zhì)速率5 000 r/min。利用噴霧干燥機進行噴霧干燥，進料溫度140 ℃，進料速度11 mL/min，測其包埋率。

(4) 均質(zhì)速率的確定：按照步驟1.3.1、1.3.2、1.3.3制備魚油三級乳狀液，其中初級乳狀液中魚骨明膠濃度1.5 g/L，二級乳狀液中褐藻多糖濃度1.0 g/L，三級乳狀液中魚骨明膠濃度2.5 g/L，超聲溫度30 ℃，超聲時間15 min，均質(zhì)時間4 min，均質(zhì)速率分別為1 000，3 000，5 000，7 000，10 000 r/min。利用噴霧干燥機進行噴霧干燥，進料溫度140 ℃，進料速度11 mL/min，測其包埋率。

1.3.6 魚油微膠囊制備的正交試驗 以微膠囊包埋率為指標，超聲時間、超聲溫度、均質(zhì)時間、均質(zhì)速率為考察因素，根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果設計四因素三水平正交試驗。

1.3.7 魚油微膠囊包埋率的測定 根據(jù)石燕等[17]的方法測定魚油微膠囊的表面含油量，根據(jù)楊小斌等[4]的方法測定魚油微膠囊的總含油量，按式(1)計算魚油微膠囊的包埋率。

(1)

式中：

A——魚油微膠囊的包埋率，%；

A1——魚油微膠囊的表面含油量，%；

A2——魚油微膠囊的總含油量，%。

1.3.8 過氧化值的測定 按GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》的滴定法執(zhí)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗中所有分析重復兩次，每次做3個平行測定，結(jié)果以平均值±SD表示，方差分析使用IBM SPSS 22.0軟件，顯著性差異檢驗使用Duncan多重檢驗，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚骨明膠濃度對初級乳狀液Zeta電位的影響

Zeta電位可以表示分散體系的穩(wěn)定性，Zeta電位的絕對值越高表明體系越穩(wěn)定，穩(wěn)定性受分散體系中顆粒大小和顆粒表面狀態(tài)影響。Zeta電位絕對值在0～5 mV時體系會快速凝結(jié)或凝聚；10～30 mV開始變得不穩(wěn)定；>30 mV體系具有較好的穩(wěn)定性[18]。由圖1可知，初級乳狀液的Zeta電位均呈正值，是因為實驗室所制得的魚骨明膠等電點為6.8，而試驗中乳狀液是在pH為4.0的條件下制備的，低于等電點時，魚骨明膠帶正電荷。初級乳狀液的Zeta電位隨魚骨明膠濃度的增加呈先升高后下降的趨勢。當魚骨明膠濃度為1.5 g/L時，Zeta電位絕對值最大，乳化顆粒之間分散性最大，所得乳狀液最穩(wěn)定。

2.2 褐藻多糖濃度對二級乳狀液Zeta電位的影響

由魚骨明膠所包埋的初級乳狀液液滴表面所帶電荷為正，褐藻多糖所帶電荷為負，因此，褐藻多糖分子與液滴表面之間存在強的靜電相互吸引作用，從而使其吸附到初級乳狀液的液滴表面。如圖2所示，當褐藻多糖濃度為0.5 g/L時，二級乳狀液的Zeta電位為3.45 mV，說明帶負電的褐藻多糖分子吸附到帶正電的魚骨明膠表面上，正負電荷中和，液滴所帶靜電荷逐漸減少。隨著褐藻多糖濃度的增加，二級乳狀液的Zeta電位轉(zhuǎn)變?yōu)樨撝担耶敐舛葹?.0 g/L時，二級乳狀液表面的Zeta電位最低，乳狀液最穩(wěn)定。這是因為液滴表面吸附了越來越多的帶負電荷的褐藻多糖分子，直至完全被褐藻多糖所覆蓋，液滴之間存在較強的靜電和空間位阻作用，乳狀液的穩(wěn)定性得到提高[19]。當褐藻多糖濃度過高，已經(jīng)超過飽和吸附所需的濃度時，二級乳狀液的Zeta電位絕對值又逐漸減小，可能是因為水相中過多的褐藻多糖分子未被吸附而產(chǎn)生損耗絮凝，導致二級乳狀液的穩(wěn)定性下降。

圖1 魚骨明膠不同濃度下初級乳液Zeta電位的變化

Figure 1 Changes in Zeta potential of primary emulsion with different fish bone gelatin concentrations

2.3 魚骨明膠濃度對三級乳狀液Zeta電位的影響

由圖3可知，隨著魚骨明膠濃度的增加，三級乳狀液Zeta電位呈先升高后降低的趨勢。當魚骨明膠濃度為1.0 g/L時，液滴表面的Zeta電位接近0，因為魚骨明膠分子的正電荷與褐藻多糖分子的負電荷相互中和，從而使得液滴表面的靜電荷接近于0。隨后Zeta電位轉(zhuǎn)變?yōu)檎?，且在魚骨明膠濃度達到2.5 g/L時達到最大值，說明

圖2 褐藻多糖不同濃度下二級乳液Zeta電位的變化

Figure 2 Changes in Zeta potential of secondary emulsion with different fucoidin concentration

圖3 魚骨明膠不同濃度下三級乳液Zeta電位的變化

Figure 3 Changes in Zeta potential of tertiary emulsion with different fish bone gelatin concentrations

此時乳化顆粒之間分散性最大，所得乳狀液最穩(wěn)定。綜合圖1～3可知，隨著乳狀液級數(shù)的增加，Zeta電位的最大值逐漸降低，穩(wěn)定性逐漸下降。三級乳狀液Zeta電位的最大值為15.81 mV，已處于開始變得不穩(wěn)定狀態(tài)，因此，試驗選擇乳狀液的最大級數(shù)為三級，魚油微膠囊的最多層數(shù)為3層。

2.4 超聲時間對微膠囊包埋率的影響

利用超聲的空穴作用可以改善乳狀液的穩(wěn)定性，促使魚油在水溶液中分散成更細小、更均一的液滴，提高微膠囊的包埋率。由圖4可知，超聲10 min時，魚油包埋率較低，隨著超聲時間的增加，包埋率顯著上升(P<0.05)，且在超聲時間為15 min時，達到最大值，繼續(xù)延長超聲時間，魚油包埋率出現(xiàn)略微下降的趨勢。董華強等[20]也報道在較短的處理時間范圍內(nèi)，超聲波處理明顯地提高了番茄紅素的包埋率，而隨著處理時間的延長，超聲效果增加變得較平緩或不明顯。

2.5 超聲溫度對微膠囊包埋率的影響

由圖5可知，多層魚油微膠囊的包埋率隨著超聲溫度的提高而逐漸增加，當超聲溫度為30 ℃時，包埋率達到最大值，隨后溫度繼續(xù)升高導致包埋率迅速降低(P<0.05)。作為一種能量形式，超聲波具有加熱和空穴雙重作用。當超聲溫度較低時，主要以加熱作用為主，反應體系中吸收了超聲波能量，使分子運動得到加速進行；當溫度超過特定值時，由于空穴作用使液體介質(zhì)中形成的微泡破裂并伴隨能量的釋放，在此過程中會產(chǎn)生瞬時局部高溫、高壓，破壞分子的構(gòu)象，進而降低包埋率[21]。

圖4 超聲時間對魚油微膠囊包埋率的影響

Figure 4 Effect of ultrasound time on the microencapsulation efficiency of fish oil

圖5 超聲溫度對魚油微膠囊包埋率的影響

Figure 5 Effect of ultrasound temperature on the microencapsulation efficiency of fish oil

2.6 均質(zhì)時間對微膠囊包埋率的影響

魚油微膠囊的包埋率隨均質(zhì)時間的增加呈先升高后降低的趨勢(圖6)。這是因為當均質(zhì)時間較短時，芯材與壁材沒有完全混勻，包埋率較低，而均質(zhì)時間過長則不利于乳狀液的穩(wěn)定性。均質(zhì)4 min和6 min制得的多層魚油微膠囊包埋率沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.7 均質(zhì)速率對微膠囊包埋率的影響

由圖7可知，均質(zhì)速率為5 000 r/min時，多層魚油微膠囊的包埋率最高，達到85.87%。均質(zhì)速率過小(<5 000 r/min)時，魚油及壁材的分子運動較緩慢，使得魚油不能充分地進入到壁材內(nèi)部；而均質(zhì)速率過大(>5 000 r/min)時，乳狀液體系被破壞，穩(wěn)定性降低，液體容易出現(xiàn)飛濺，造成較大的損失[22]。

2.8 魚油微膠囊正交試驗

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，確定各因素的水平見表1，試驗設計和結(jié)果見表2。

圖6 均質(zhì)時間對魚油微膠囊包埋率的影響

Figure 6 Effect of homogenization time on the microencapsulation efficiency of fish oil

圖7 均質(zhì)速率對魚油微膠囊包埋率的影響

Figure 7 Effect of homogenization rate on the microencapsulation efficiency of fish oil

由表2可知，各因素對多層魚油微膠囊包埋率影響的主次順序為：B>D>C>A，即超聲溫度>均質(zhì)速率>均質(zhì)時間>超聲時間，分析得出的多層魚油微膠囊最佳工藝條件是A1B1C2D2，即超聲時間10 min，超聲溫度25 ℃，均質(zhì)時間4 min，均質(zhì)速率5 000 r/min。采用上述最優(yōu)工藝條件進行多層魚油微膠囊包埋的驗證實驗，得到多層魚油微膠囊的包埋率為82.03%，高于正交試驗組的結(jié)果(表2)。

表1 L9 (34 )正交試驗設計因素水平

Table 1 Factors and their coded level used in L9 (34 )orthogonal array design

水平A超聲時間/minB超聲溫度/℃C均質(zhì)時間/minD均質(zhì)速率/(r·min-1)1102523 0002153045 0003203567 000

表2 魚油微膠囊制備正交試驗

Table 2 Orthogonal experiment of fish oil microcapsule preparation

試驗號ABCD多層魚油微膠囊包埋率/%1111161.782122281.253133362.654212379.885223165.486231259.467313276.718321364.309332155.58k168.5672.7961.8560.95k268.2770.3472.2472.47k365.5359.2368.2868.94R3.0313.5610.3911.53

2.9 魚油微膠囊的貯藏穩(wěn)定性

魚油中富含PUFAs，在貯藏過程中極易發(fā)生氧化反應生成氫過氧化物。隨后，氫過氧化物可發(fā)生聚合反應生成聚合物，或迅速分解為醛、酮、酸、醇、酯等二級產(chǎn)物，使魚油產(chǎn)生哈喇味，導致其食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值降低[2]。圖8為魚油和魚油微膠囊在貯藏過程中過氧化值的變化情況。魚油微膠囊化前后的初始過氧化值并沒有顯著性差異(P>0.05)，說明乳狀液的制備過程及噴霧干燥時的高溫作用并不會對魚油的品質(zhì)產(chǎn)生負面影響。未包埋的魚油在貯藏過程中其過氧化值從14.20 g/100 g迅速上升到69.45 g/100 g。這可能是由于魚油與空氣接觸后發(fā)生自動氧化反應，使過氧化物不斷增加。而魚油微膠囊的過氧化值在貯藏過程中上升緩慢，尤其是3層魚油微膠囊的過氧化值變化最小。這是因為褐藻多糖具有抗氧化作用，可以延緩魚油的氧化速率，延長魚油產(chǎn)品的貨架期。同時，魚油微膠囊化后，減少了魚油與空氣中的氧氣接觸的機會，而且，隨著自組裝微膠囊壁材層數(shù)的增加，魚油的氧化穩(wěn)定性得到提高，與Guzey等[23]的研究結(jié)果相一致。Dai等[24]也發(fā)現(xiàn)隨著壁材厚度(聚合物電解質(zhì)層數(shù))的增加，VK3的穩(wěn)定性逐漸升高，釋放速率逐漸降低。

3 結(jié)論

制備初級乳狀液所需魚骨明膠的最適濃度為1.5 g/L，制備二級乳狀液所需褐藻多糖的最適濃度為1.0 g/L，制備三級乳狀液所需魚骨明膠的最適濃度為2.5 g/L，在此條件下乳狀液最穩(wěn)定。制備多層魚油微膠囊的最佳工藝條件為超聲時間10 min，超聲溫度25 ℃，均質(zhì)時間4 min，均質(zhì)速率5 000 r/min，此時3層魚油微膠囊的包埋率為82.03%。微膠囊化可以明顯提高魚油的貯藏穩(wěn)定性，且3層魚油微膠囊的氧化速率最低。試驗得到了多層魚油微膠囊的層層自組裝最佳工藝，但未對魚油微膠囊的結(jié)構(gòu)進行表征。今后可采用掃描電子顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜等手段研究多層魚油微膠囊結(jié)構(gòu)形成過程中壁材和魚油間的相互作用；同時，利用體外模擬消化分析多層魚油微膠囊的緩釋作用及其機理。

圖8 魚油及魚油微膠囊在貯藏過程中過氧化值的變化

Figure 8 Changes of peroxide value of fish oil and fish oil microcapsules during storage