任海偉 - 石菊芬 - 王曼琪 - 范文廣 - 李志忠 -

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

生物體的正常代謝和外部刺激(包括吸煙、空氣污染物和工業(yè)化學(xué)品)都會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生大量的不穩(wěn)定自由基，這些自由基易與體內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和核酸等發(fā)生反應(yīng)，引起氧化損傷細(xì)胞或組織，甚至導(dǎo)致基因突變[1]。

人工合成的抗氧化劑(如BHA、BHT)抗氧化效果雖好，但對(duì)人體有潛在毒副作用，尋找天然安全的生物抗氧化劑已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)?？寡趸氖且环N具有抗氧化能力、生物安全性高的肽類物質(zhì)，能抑制或阻止底物被氧化，是生物抗氧化劑的良好來(lái)源。動(dòng)物源活性肽營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，與人體營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)吻合性好；進(jìn)入人體后會(huì)選擇性作用于相應(yīng)器官，靶向效應(yīng)好，更益于吸收；合理的氨基酸組成使其抗氧化能力優(yōu)于植物源肽[2]。研究表明，山羊胎盤喂食幼犬后能增強(qiáng)血清總抗氧化能力、血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性[3]；山羊或小尾羊胎盤肽具有良好的DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基清除能力，抗氧化活性較好[4]。張丙云等[5]曾對(duì)復(fù)合酶法制備藏系綿羊胎盤肽的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，但有關(guān)藏系綿羊胎盤肽的抗氧化能力研究還未見(jiàn)報(bào)道。

常見(jiàn)的體外抗氧化化學(xué)分析方法主要有脂質(zhì)氧化降解、自由基清除和螯合金屬離子等，根據(jù)作用機(jī)理可分為基于單電子轉(zhuǎn)移(Fe3+和Cu2+還原能力、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力)和氫原子轉(zhuǎn)移(超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力、金屬離子螯合能力)兩種[6]。試驗(yàn)擬以藏綿羊胎盤肽為研究對(duì)象，通過(guò)6種不同的體外化學(xué)評(píng)價(jià)體系探討其抗氧化能力，利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、掃描電鏡(SEM)、X-射線衍射(XRD)和圓二色光譜(CD)等方法表征其結(jié)構(gòu)變化，并結(jié)合肽的氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量分布剖析藏綿羊胎盤肽的抗氧化能力成因，為藏綿羊胎盤資源的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏綿羊胎盤：蛋白質(zhì)含量87.50%，蘭州名德藥業(yè)有限公司；

木瓜蛋白酶(酶活力8×105U/g)和中性蛋白酶(酶活力6×104U/g)：北京索萊寶科技有限公司；

總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒、Cupric ion reducing antioxidant capacity(CUPRAC)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、二丁基羥基甲苯(BHT)、1,10-鄰二氮雜菲及菲洛嗪：美國(guó) Sigma公司；

牛血清白蛋白：上海伯奧生物科技有限公司；

其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高剪切分散乳化機(jī)：FA25型，上海弗盧克流體機(jī)械制造有限公司；

酶標(biāo)儀：SpectraMax i3x型，美谷分子儀器(上海)有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-18N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

圓二色光譜儀：JASCO-200C型，日本島津公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-5600LV型，日本電子光學(xué)公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Nexus 670型，美國(guó) Nicolet公司；

高效液相色譜儀：Waters 1525型，美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 羊胎盤肽粉的制備 取一定量潔凈的羊胎盤原料剪碎，與蒸餾水以1∶5 (g/mL)比例混勻配成勻漿液，經(jīng)超聲波預(yù)處理(功率438 W，時(shí)間16.5 min，溫度25.5 ℃)后，以8 000 U/g加酶量加入復(fù)合蛋白酶(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=3∶7)，50 ℃、pH 7.0下水解4.9 h，離心，濃縮，冷凍干燥，得羊胎盤肽粉(簡(jiǎn)稱肽粉)[7]。

1.3.2 多肽含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取100 mg肽粉配制成濃度為10 mg/mL的粗肽液，量取2.5 mL粗肽液，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混勻靜置10 min，5 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液置于10 mL比色管中，加入4 mL雙縮脲試劑混勻，37 ℃恒溫顯色30 min，測(cè)定540 nm處吸光度值，對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.054 8x-0.019 9(R2=0.992)。

1.3.3 相對(duì)分子質(zhì)量分布分析 采用高效液相色譜儀測(cè)量相對(duì)分子質(zhì)量分布，分析柱為TSKgel 2000 SWXL300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相為乙腈/水/三氟乙酸(40/60/0.1，體積比)，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm[7]。

1.3.4 氨基酸組成分析 精確稱取1.00 g肽粉置于水解管中，加入5%三氯乙酸溶液溶解并靜置沉淀2～3 h，雙層濾紙過(guò)濾，取1 mL濾液離心，觀察無(wú)沉淀或無(wú)明顯分層后上機(jī)測(cè)定氨基酸組成[7]。

1.3.5 抗氧化能力測(cè)定

(1) DPPH自由基清除能力：參考Xing等[8]的方法略作修改，將2 mL不同濃度肽液(2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mg/mL)與1 mL蒸餾水、3 mL含0.1 mmol/L DPPH的無(wú)水乙醇溶液混勻，25 ℃避光反應(yīng)30 min，4 000 r/min離心20 min，測(cè)定517 nm處的吸光度值；以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液作樣品對(duì)照，蒸餾水代替肽液作空白對(duì)照，BHT作陽(yáng)性對(duì)照，DPPH自由基清除率按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

c——DPPH自由基清除率，%；

As——樣品組吸光度值；

Ax——樣品對(duì)照組吸光度值；

Ac——空白對(duì)照組吸光度值。

(2) 超氧陰離子自由基清除能力：參考Najafian等[9]的方法略作修改，將0.75 mL氮藍(lán)四唑(300 μmol/L)溶解于3 mL Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH 7.4)中，再加入0.75 mL還原型輔酶I (936 μmol/L)、0.3 mL不同濃度肽液(5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg/mL)和0.75 mL吩嗪硫酸甲酯(120 μmol/L)，室溫反應(yīng)5 min，用96孔板測(cè)定560 nm處吸光度值，以蒸餾水作空白對(duì)照，BHT作陽(yáng)性對(duì)照，超氧陰離子自由基清除率按式(2)計(jì)算。

(2)

式中：

d——超氧陰離子自由基清除率，%；

A0——樣品組吸光度值；

A1——空白對(duì)照組吸光度值。

(3) 羥基自由基清除能力：參考Xing等[8]的方法略作修改，依次將40 μL 2 mmol/L硫酸亞鐵溶液、40 μL 2 mmol/L 1,10-鄰二氮雜菲溶液和80 μL不同濃度肽液(2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mg/mL)混合，加入40 μL0.03%雙氧水，37 ℃恒溫反應(yīng)60 min，用96孔板測(cè)定536 nm處吸光度值，以無(wú)抗氧化劑為陰性對(duì)照，無(wú)雙氧水為空白對(duì)照，BHT作陽(yáng)性對(duì)照，羥基自由基清除率按式(3)計(jì)算。

(3)

式中：

e——羥基自由基清除率，%；

As——樣品組吸光度值；

Ab——空白對(duì)照組吸光度值；

An——陰性對(duì)照組吸光度值。

(4) 金屬離子(Fe2+)螯合能力：參考Zhang等[10]的方法略作修改，取0.5 mL不同濃度肽液(5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg/mL)與1.6 mL蒸餾水和0.05 mL 2 mmol/L二氯化鐵混勻，靜置30 s，加入0.1 mL 5 mmol/L菲洛嗪室溫反應(yīng)10 min，測(cè)定562 nm處吸光度值。以等體積蒸餾水代替肽液作空白對(duì)照，BHT作陽(yáng)性對(duì)照，金屬離子螯合率按式(4)計(jì)算。

(4)

式中：

f——金屬離子螯合率，%；

A0——空白對(duì)照組吸光度值；

A1——樣品組吸光度值。

(5) 鐵離子(Fe3+)還原能力：參考Wu等[11]的方法略作修改，取1 mL不同濃度肽液(5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg/mL)，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻并加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液1 mL，加入0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，加入1 mL去離子水搖勻，50 ℃恒溫水浴10 min，以蒸餾水調(diào)零并在700 nm下進(jìn)行比色分析。以BHT作陽(yáng)性對(duì)照，吸光度值越大說(shuō)明抗氧化性能力越強(qiáng)。

(6) 銅離子(Cu2+)還原能力：參照CUPRAC試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 結(jié)構(gòu)表征分析

(1) 掃描電鏡(SEM)：分別稱取適量羊胎盤原料、肽粉樣品置于導(dǎo)電膠上，固定后噴金，采用電子束對(duì)樣品進(jìn)行微觀形貌拍攝，探針電壓30 kV，電流50 pA，電子束加速電壓5 kV。

(2) 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)：將羊胎盤原料、肽粉樣品與適量溴化鉀混合置于瑪瑙研缽中，研磨數(shù)分鐘并用壓片機(jī)壓成透明小塊；然后在分辨率4 cm-1、掃描范圍4 000～400 cm-1條件下進(jìn)行FTIR譜圖采集。以溴化鉀作空白背景，進(jìn)行結(jié)果校正。

(3) X射線衍射(XRD)：將羊胎盤原料、肽粉樣品置于顯微鏡載玻片上，然后滴加一定量無(wú)水乙醇制成樣品試片，放入X射線衍射儀中。測(cè)試條件為掃描范圍(2θ)5°～80°，掃描速度2°/min，Cu-Kα射線為靶材，步長(zhǎng)0.02，電壓40 kV，電流100 mA。

(4) 圓二色譜(CD)：將羊胎盤原料、肽粉樣品分別溶解于去離子水中，置10 mm光徑樣品池，掃描波長(zhǎng)300～190 nm，掃描速度100 nm/min，響應(yīng)時(shí)間1 s。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析，采用Origin6.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊胎盤肽的相對(duì)分子量分布

由圖1可知，羊胎盤肽的分子質(zhì)量分布主要集中在1 000 Da以下，比例達(dá)89.04%；其中，分子量為500～1 000 Da的寡肽占14.05%，分子量<500 Da的小肽占74.99%，而1 000～2 000，2 000～3 000，3 000～5 000，>5 000 Da的多肽分別為5.98%，2.00%，1.56%，1.43%。說(shuō)明制備的羊胎盤肽主要以<1 000 Da的寡肽為主。

圖1 羊胎盤肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布

Figure 1 Distribution of relative molecular weight of placental peptide from tibetan sheep

2.2 羊胎盤肽的氨基酸組成

由表1可知，羊胎盤肽中Glu含量最高，羊胎盤肽中必需氨基酸 (EAA)含量豐富，組成合理，占總氨基酸(TAA)含量的34.54%，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，Ala、Met、Pro、Cys、Leu、Gly和Val對(duì)清除自由基有較好效果，上述氨基酸含量占總氨基酸含量的40.99%，此外，芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可供氫，能減慢或終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，有可能成為抗氧化肽的活性位點(diǎn)。

表1 羊胎盤肽粉的氨基酸組成?Table 1 Amino acid composition of peptide from tibetan sheep placenta mg/mL

? *為必需氨基酸。

2.3 羊胎盤肽的抗氧化能力

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖2可知，羊胎盤肽的DPPH自由基清除率隨肽濃度的增加而提高，存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，與涂宗財(cái)?shù)萚13]得出的結(jié)果一致。當(dāng)肽濃度為2～6 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率的增速最快；當(dāng)肽濃度為6 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)85.70%；當(dāng)肽濃度為6～10 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為85.70%～87.50%，差異不顯著(P>0.05)，與小尾羊胎盤肽的清除能力接近[4]。羊胎盤肽的DPPH自由基清除能力與BHT基本相當(dāng)，其IC50值分別為2.83，2.28 mg/mL，二者抗氧化能力明顯高于何小慶等[14]的結(jié)果。綜上，羊胎盤肽具有良好的DPPH自由基清除能力，可能是因?yàn)檠蛱ケP酶解過(guò)程中釋放出更多疏水性氨基酸側(cè)鏈，作為氫供體與DPPH自由基反應(yīng)，從而淬滅自由基，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[15]。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力 由圖3可知，羊胎盤肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力隨濃度的升高而快速增加，呈良好線性量效關(guān)系，當(dāng)肽濃度為25 mg/mL時(shí)，超氧陰離子自由基清除率達(dá)75.51%；當(dāng)BHT濃度為10 mg/mL 時(shí)，超氧陰離子自由基清除率已高達(dá)92.43%。

大寫或小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 DPPH自由基的清除能力Figure 2 Scavenging capacity of DPPH radical

羊胎盤肽和BHT的IC50值分別為15.17，6.89 mg/mL，前者約為后者2.2倍；與BHT相比，羊胎盤肽清除超氧陰離子自由基的能力相對(duì)較弱。

大寫或小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 超氧陰離子自由基的清除能力Figure 3 Scavenging capacity of radical

2.3.3 羥基自由基清除能力 由圖4可知，羊胎盤肽和BHT對(duì)羥基自由基清除率的變化趨勢(shì)基本相同。當(dāng)肽濃度為2～6 mg/mL時(shí)，羊胎盤肽對(duì)羥基自由基清除率與濃度呈正相關(guān)；當(dāng)肽濃度>10 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)84.46%，明顯高于小尾羊胎盤肽的清除能力(46.88%)[4]。羊胎盤肽和BHT的IC50值分別為0.94，2.62 mg/mL，前者清除羥基自由基能力強(qiáng)于BHT，也明顯優(yōu)于羊肝抗氧化肽(IC50值為17.01 mg/mL)[16]。這可能是因?yàn)檠蛱ケP肽中含有離子化的氨基或羧基等供氫體，能提供質(zhì)子還原具有氧化性的自由基，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，達(dá)到清除或抑制目的。

2.3.4 金屬離子(Fe2+)螯合能力 由圖5可知，羊胎盤肽對(duì)Fe2+螯合率隨肽濃度的增加而快速增強(qiáng)，呈明顯量效關(guān)系；BHT對(duì)Fe2+螯合率也表現(xiàn)出相同趨勢(shì)，二者IC50值分別為18.19，15.33 mg/mL。與魚肌原纖維蛋白對(duì)Fe2+螯合率(IC50值為42.98 mg/mL)相比[9]，羊胎盤肽表現(xiàn)出優(yōu)良的Fe2+螯合能力，主要是因?yàn)檠蛱ケP經(jīng)酶水解后的游離組氨酸含量增加，而組氨酸中咪唑基的氨基可與Fe2+螯合，從而減少游離Fe2+濃度。此外，具有螯合金屬離子能力的活性短肽鏈逐漸暴露也是具有良好螯合能力的原因之一[10]。

大寫或小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 羥自由基的清除能力Figure 4 Scavenging capacity ofhydroxyl radical

大寫或小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 金屬離子螯合能力Figure 5 The Ferrous iron-chelation capacity

2.3.5 鐵離子(Fe3+)還原能力 由圖6可知，羊胎盤肽和BHT在700 nm處的吸光度值隨其濃度的提高而增強(qiáng)，但I(xiàn)C50值相差明顯，分別為14.32，0.04 mg/mL；與BHT相比，羊胎盤肽的還原力表現(xiàn)一般。Zhou等[16]發(fā)現(xiàn)鮑足肌抗氧化肽的Fe3+還原力IC50值為15 mg/mL，與羊胎盤肽能力相似。

2.3.6 銅離子(Cu2+)還原能力 由圖7可知，當(dāng)肽濃度為2～10 mg/mL時(shí)，羊胎盤肽對(duì)Cu2+還原能力隨肽濃度的增加而顯著升高，IC50值為8.91 mg/mL；相同濃度下羊胎盤肽的還原能力始終低于BHT(IC50值為1.91 mg/mL)。一般認(rèn)為某物質(zhì)的IC50值低于10 mg/mL時(shí)具有較好的抗氧化性，表明羊胎盤肽具有較強(qiáng)的Cu2+還原力和抗氧化能力，但仍弱于BHT。

2.4 結(jié)構(gòu)表征分析

2.4.1 傅里葉變換紅外光譜 由圖8可知，羊胎盤在3 430 cm-1處吸收峰屬于酰胺A帶，是由游離態(tài)O—H伸縮振動(dòng)引起的；2 930 cm-1處吸收峰為C—H伸縮振動(dòng)；1 650 cm-1處吸收峰歸屬于酰胺I帶，是由C—O伸縮振動(dòng)所引起。研究[17]表明，1 650～1 660 cm-1為α-螺旋，1 600～1 640 cm-1為β-折疊，說(shuō)明羊胎盤中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要為致密的α-螺旋。羊胎盤在1 540 cm-1處吸收峰為酰胺Ⅱ帶特征范圍，主要由N—H鍵彎曲振動(dòng)引起；1 240 cm-1處吸收峰證明了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性[22]；1 410～1 100 cm-1處吸收峰主要由極性C—O鍵伸縮振動(dòng)引起。

大寫或小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 鐵離子還原力Figure 6 Reduction capacity of Ferric iron

大寫或小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 銅離子還原力Figure 7 Reducing capacity of cupric ion

當(dāng)?shù)鞍酌附鉃殡暮?，特征吸收峰出現(xiàn)了小幅移動(dòng)，3 430 cm-1處吸收峰由尖銳變得平緩且發(fā)生紅移，可能是由于游離態(tài)O—H伸縮振動(dòng)與氫鍵締合，致使O—H鍵長(zhǎng)增大，并向低波數(shù)位移，活潑羥基變少。2 930 cm-1處吸收峰變?nèi)醣砻鞯鞍踪|(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵斷裂變?nèi)酰? 650 cm-1處吸收峰發(fā)生變化可能是酰胺I帶(C═O伸縮振動(dòng))的β折疊，酰胺I帶特征峰由多肽骨架的C═O伸縮振動(dòng)在特定的氫鍵環(huán)境下引起的，其對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化十分敏感，是描述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的最主要峰，吸收峰發(fā)生紅移且峰型變寬，說(shuō)明超聲輔助酶解導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致密有序的α-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，β-折疊結(jié)構(gòu)增多，同時(shí)也表明酶解羰基增加，蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)生了更多小分子肽；1 540 cm-1處吸收峰消失說(shuō)明酶解作用使部分肽鍵斷裂，大分子蛋白裂解為肽；1 410 cm-1處羰基對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰變尖銳表明酶解后—COOH含量增加?？傊?，二者紅外光譜圖基本相同，表明酶解在一定程度上改變了峰的位置、強(qiáng)度和面積，但并沒(méi)有出現(xiàn)新的功能團(tuán)，即酶解改變了蛋白各種構(gòu)象所占的比例，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化，與溫慧芳等[18]的研究結(jié)果一致。

圖8 羊胎盤和羊胎盤肽的紅外光譜圖Figure 8 FTIR of sheep placenta and sheep placenta peptide

2.4.2 掃描電鏡 由圖9可知，羊胎盤原料酶解前后的微觀結(jié)構(gòu)差異明顯。羊胎盤原料呈連續(xù)凹凸不平、不規(guī)則的大孔海綿狀結(jié)構(gòu)，且有少數(shù)片狀結(jié)構(gòu)存在。酶解后，羊胎盤的完整結(jié)構(gòu)被破壞，表面不規(guī)則凹陷明顯消失，變成大量緊密聚集的小球狀顆粒，不規(guī)則碎片減少。這可能是酶解過(guò)程使蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和范德華力被超聲波的空化作用產(chǎn)生的局部微射流及震蕩波所產(chǎn)生的剪切力所破壞，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，粒徑減小，蛋白質(zhì)表面暴露出更多的疏水性基團(tuán)，進(jìn)而提高酶解產(chǎn)物的抗氧化能力。

2.4.3 X-射線衍射 由圖10可知，羊胎盤在20°左右有較強(qiáng)吸收峰，而羊胎盤肽在18°，22°，31°左右有強(qiáng)吸收峰，且吸收峰變尖銳，說(shuō)明酶解反應(yīng)使大分子蛋白在降解過(guò)程中發(fā)生重排和聚集，形成了更多穩(wěn)定的小分子肽結(jié)晶體。含有高比例的疏水性氨基酸殘基比親水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)一般更為穩(wěn)定，說(shuō)明經(jīng)酶解后疏水性氨基酸含量提高，抗氧化活性增強(qiáng)[19]。

2.4.4 圓二色譜 由表2可知，羊胎盤酶解后的α-螺旋結(jié)構(gòu)(緊密且沒(méi)有空腔的穩(wěn)定結(jié)構(gòu))含量降低，β-折疊及無(wú)規(guī)則卷曲含量顯著升高，β-轉(zhuǎn)角含量增加不明顯，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面疏水性變大，與紅外光譜結(jié)論一致。這可能是超聲輔助酶解可以破壞蛋白質(zhì)間氫鍵和肽鍵進(jìn)而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，羊胎盤蛋白的空間結(jié)構(gòu)展開，蛋白質(zhì)分子內(nèi)無(wú)序結(jié)構(gòu)含量相對(duì)較高，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲增加，使得隱藏在內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)更多地顯露出來(lái)，從而發(fā)揮特定的功能作用，這也是羊胎盤肽表現(xiàn)出一定抗氧化能力的原因之一。

圖9 羊胎盤和羊胎盤肽的電鏡掃描圖

Figure 9 SEM photograph of sheep placenta and sheep placenta peptide (5 000×)

圖10 羊胎盤和羊胎盤肽的X射線衍射圖

Figure 10 XRD diagrams of sheep placenta and sheep placenta peptide

表2 羊胎盤及羊胎盤肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)

Table 2 Secondary structure of sheep placenta the and sheep placenta peptide %

由圖11可知，羊胎盤及胎盤肽在192 nm處均有一正峰α-螺旋特征峰，216 nm附近有一個(gè)負(fù)峰β-折疊特征峰，為典型的蛋白質(zhì)圓二色光譜圖。

2.5 不同動(dòng)物源肽的抗氧化能力比較

由表3可知，藏綿羊胎盤肽清除羥自由基能力稍弱于鮑魚水解肽、卵白蛋白低聚肽和山羊胎盤肽，但明顯強(qiáng)于其他動(dòng)物源肽，可能與其分子量分布、分子中活潑氫原子數(shù)量及其位置有關(guān)[9]。研究[20]表明，分子量<1 000 Da抗氧化肽的羥自由基清除能力要優(yōu)于>1 000 Da的肽片段。試驗(yàn)中羊胎盤肽分子量<1 000 Da的肽約占90%，同時(shí)小分子肽片段還能產(chǎn)生離子化氨基和羧基，易提供電子或氫原子干擾氧化，進(jìn)而終止自由基介質(zhì)導(dǎo)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[21]。

圖11 羊胎盤和羊胎盤肽的圓二色譜圖

Figure 11 CD spectrum of sheep placenta and sheep placenta peptide

表3 不同動(dòng)物來(lái)源肽的抗氧化能力比較?Table 3 Antioxidant capacity comparison of different animal-derived antioxidative peptides

? “—”表示文獻(xiàn)中無(wú)報(bào)道數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

藏綿羊胎盤肽具有良好的自由基清除能力，而還原能力和金屬離子螯合能力相對(duì)較弱，且存在一定劑量依賴性。羊胎盤蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)、結(jié)晶性能、蛋白分子構(gòu)象和α螺旋、β折疊等空間結(jié)構(gòu)的積極變化有助于小分子寡肽的抗氧化能力釋放。后續(xù)仍需通過(guò)凝膠色譜、反相高效液相色譜等方法分離篩選高活性的抗氧化肽片段，并從氨基酸序列解析等角度進(jìn)一步明確藏綿羊胎盤肽的抗氧化能力構(gòu)效關(guān)系。