李全發(fā) - 于寒松,2 -,2 王 敏 周 劍

(1. 吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2. 國家大豆產業(yè)技術體系研發(fā)中心加工實驗室,吉林 長春 130118；3. 中國農業(yè)科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，北京 100081)

大豆異黃酮(soybean isoflavone，SI)是大豆生長過程中形成的次級代謝產物, 又稱植物雌激素，它是多酚類混合物，具有多種生物活性[1]。大豆異黃酮在常溫下的性質穩(wěn)定，易溶于醇類、酯類、酮類溶劑和稀堿中，不溶于水，難溶于石油、乙醚、苯等非極性有機溶劑。大豆異黃酮作為異黃酮類化合物，具有異黃酮類化合物所共有的理化性質。其中染料木素呈長方形或六邊形棒狀結晶(60%乙醇)、樹枝狀結晶(乙醚)，溶于DMSO和Meth，幾乎不溶于水，改變溶液pH對染料木素沒有明顯影響。染料木素結構式如圖1所示。

圖1 染料木素分子結構式Figure 1 Molecular structure of Genistein

隨著研究的深入，科學家們發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮具有多種生物活性，如抗氧化活性[2]、抗癌活性[3-4]、類雌激素[5]及抗雌激素活性[6]，還可以預防心血管疾病[7]、改善更年期綜合癥[8]等，不同組分的大豆異黃酮生物活性也不相同[9-10]。同時，許多學者也建立了很多分析大豆異黃酮含量的方法，例如高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)[11-12]、高效液相色譜質譜聯(lián)用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS)[13-15]、氣相色譜法(Gas Chromatography， GC)[16]、氣相色譜質譜聯(lián)用法(Gas Chromatographic-Mass Spectrometric，GC-MS)[17-18]等，這些方法的建立可為相關大豆異黃酮的定量測定提供參考依據[19]。楊得志等[20]采用DSC法和CT法兩種不同原理的定量方法研制了染料木素的標準物質，筆者在對染料木素原料采用DSC法進行純度初測時，發(fā)現(xiàn)染料木素在檢測溫度接近270 ℃時，會變?yōu)榻购隣?，造成DSC基線大幅度變化，不利于積分，從而降低了定值的準確度；同時庫倫滴定法(CT)在配置電解液時比較繁瑣，且不易判斷滴定終點。

為了提高定值的準確性及簡化定值過程，試驗擬采用質量平衡法(Mass Balance Method，MB)及定量核磁氫譜法(Quantitative- Nuclear Magnetic Resonance，q-NMR)對染料木素展開定值研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Waters 2695型，配有可變波長紫外檢測器和Empower工作站，美國Waters公司；

質譜儀：AB SCIEX Triple Quad 3500型，配電噴霧離子源(ESI)，美國AB SCIEX公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：IRT racer-100型，美國Agilent公司；

核磁共振儀器：Avance III 400 MHz型，德國Bruker公司；

氣相色譜儀：Agilent 7890A型，配氫火焰離子化檢測器FID、HS-10型頂空進樣器，美國Agilent公司；

卡爾費休水分滴定儀：DO DL32型，瑞士Mettler Toledo公司；

紫外/可見光分光光度計：VAVODROP 2000c型，美國Thermo Fisher公司；

分析天平：XS105型，瑞士Mettler Toledo公司；

電子天平：UMX2型，瑞士Mettler Toledo公司；

電感耦合等離子體質譜儀：X series 2型，美國Thermo Fisher公司；

核磁管：5 mm經濟型，美國Wilmad公司。

1.1.2 材料與試劑

染料木素：純度>98%，美國Chroma Dex公司；

乙腈、甲醇、異丙醇、二氯甲烷、二甲苯：色譜純，德國Merck公司；

氘代甲醇：99.8%，美國Sigma公司；

乙酸乙酯(GBW 06114)、丙酮(GBW 06115)、正己烷(GBW 06116)、一級標準物質苯甲酸(GBW 06117)：中國計量科學院；

DMSO-d6：北京百靈威科技有限公司。

1.2 定性分析

根據文獻[21]，對市售的染料木素純品原料進行定性分析，主要包括質譜法、紅外光譜法和核磁氫譜法。

1.3 樣品分裝

稱取染料木素原料3 g，采用加熱及冷凍干燥的方法去除水分。將干燥的樣品與研缽中攪拌混合約2 h后，進行分裝。每個包裝分裝量20.0～22.0 mg，分裝不少于100瓶。將其密封并保存于干燥室溫(20 ℃)下。

1.4 均勻性和穩(wěn)定性考察

1.4.1 均勻性 根據文獻[21]中的方法，考察染料木素原料分裝的均勻性，檢測方法與液相色譜法測定原料的主成分純度方法相同。

1.4.2 穩(wěn)定性 根據文獻[21]中的方法，考察染料木素的長期穩(wěn)定性及短期穩(wěn)定性，分別檢驗其在儲存條件及運輸過程中量值的變化。檢測方法與液相色譜法測定原料的主成分純度方法相同。

1.5 定值

1.5.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

(1) 色譜柱的選擇：比較ZORBAX Agilent SB-Aq (250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，Eclipse Agilent Plus-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，Thermo ODS-2 (250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，Eclipse Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm) 4種不同色譜柱對于染料木素及其雜質的分離情況。

(2) 流動相比例優(yōu)化：以0.15%磷酸水溶液為水相，乙腈為有機相，考察3種不同流動相比例條件下染料木素及其雜質的分離情況。

(3) 定值波長的選擇：根據標準物質的定值原則，要求雜質響應最充分的波長為定值波長。選取220，230，260，290，320，350 nm 6個不同的波長進行優(yōu)化。

(4) 樣品濃度的選擇：針對雜質響應程度，考察100，500，1 000，3 000 mg/L 4種不同濃度的染料木素甲醇溶液中雜質出峰情況。

1.5.2 質量平衡法定值 采用液相色譜法測定原料的主成分純度，分別取6支分裝的樣品配制濃度為500 mg/mL的檢測溶液，每支樣品配制3次，分別檢驗。

根據文獻[21]對染料木素中的雜質進行分析，主要包括卡爾費休法測定水分，微波消解—電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測定無機金屬元素雜質，頂空氣相色譜法測定揮發(fā)性雜質。

1.5.3 定量峰選擇 選擇積分范圍內無干擾峰，含有多個氫的單峰作為定量峰[22]，以減少定值誤差。

1.5.4 核磁共振氫譜法定值 樣品配制方法：分別準確稱量約22.000 mg樣品和10.000 mg內標物于同一透明玻璃瓶，用1 mL DMSO-d6完全溶解后，轉移至核磁管中待測。根據文獻[23]中的方法，將激發(fā)中心設置為δ8.15進行檢測。

2 結果與討論

2.1 主成分定性分析

2.1.1 傅里葉紅外光譜法 采用SHIMADZU IRT racer-100紅外光譜儀測定染料木素的紅外光譜圖，結果如圖2所示。其中3 410 cm-1為O—H鍵的伸縮振動；1 652.51 cm-1為C═O雙鍵的伸縮振動；1 615.38，1 519.91 cm-1為苯環(huán)的骨架震動；1 309.67 cm-1為O—H鍵的彎曲震動；1 202.13 cm-1為C—O鍵的伸縮振動；840.48 cm-1為苯環(huán)上C—H的彎曲振動。與文獻[24]報道的染料木素紅外譜圖比較，峰的位置一一對應，因此可以初步判斷染料木素樣品的結構準確。

圖2 染料木素的紅外光譜圖Figure 2 Infrared spectrum of Genistein

2.1.2 質譜法 采用質譜法測定化合物的母離子、子離子，可以為化合物準確定性提供依據。將染料木素純品溶于甲醇溶劑中，配成1 mg/L的溶液，采用AB SCIEX Triple Quad 3500質譜儀在正離子模式下全掃分析，質譜圖如圖3所示，質荷比分別為271.0，215.1，153.0，與文獻[13]記載的定性離子對相符合。由此認為，純品原料主要成分為染料木素。

2.1.3 核磁氫譜法 如圖4(a)所示，化學位移值在δ6.21，6.37，6.81，7.37的峰分別歸屬于苯環(huán)上所連接8、11、15、16號位置的氫，化學位移為δ12.95的峰為18號位羥基上的氫。且測得的樣品中氫原子的化學位移值與通過Chemdraw模擬的染料木素的核磁氫譜圖[圖4(b)]的化學位移值均一一對應。綜合以上3種定性方法的結果，最后判斷原料的主成分為染料木素。

圖3 染料木素的質譜圖Figure 3 Mass spectrum of Genistein

2.2 均勻性考察

根據標準物質研制的相關技術要求[25][26]1-3，研究從整個封裝過程的前、中、后3個時間段分別隨機抽取樣品，共11個包裝單位進行均勻性檢驗。采用單因素方差分析法檢驗測量的數據，均勻性檢驗結果如表1所示。由表1可知，F(xiàn)

2.3 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性考察主要為檢驗標準物質在長期儲存條件和不同運輸環(huán)境溫度下，標準物質的理化性質和量值保持不變的能力。對染料木素純度標準物質進行了長期和短期的穩(wěn)定性考察，并采用直線擬合法考察穩(wěn)定性結果。

2.3.1 長期穩(wěn)定性考察 長期穩(wěn)定性考察及監(jiān)測結果如表2所示，由擬合直線的線性方程可知，斜率β1=0.002和截距β0=99.634，且∣β1∣

2.3.2 短期穩(wěn)定性考察 采用趨勢分析對監(jiān)測數據進行考察，結果(如表3所示)顯示，3種溫度條件下∣β1∣

圖4 染料木素的核磁氫譜圖Figure 4 1H-NMR spectrum of Genistein

表1 染料木素均勻性檢驗結果?

表2 染料木素長期穩(wěn)定性考察結果?Table 2 The results of long-term stability of Genistein %

?β1為2.00E-03，β0為99.634，s2為9.611E-05，s(β1)為1.016E-03，t0.95，3為3.180。

表3 染料木素短期穩(wěn)定性考察結果?Table 3 The results of short-term stability of Genistein %

? 20 ℃：β1為-5.00E-03，β0為99.65，s2為3.00E-04，s(β1)為2.89E-03，t0.95，2為4.30；40 ℃：β1為-2.00E-03，β0為99.63，s2為6.00E-05，s(β1)為1.29E-03，t0.95，2為4.30；60 ℃：β1為-1.50E-03，β0為99.62，s2為1.55E-05，s(β1)為6.60E-04，t0.95，3為4.30。

2.4 質量平衡法定值

2.4.1 高效液相色譜條件優(yōu)化 研究考察HPLC在不同色譜柱、流動相比例、檢測波長和樣品濃度條件下，染料木素液相色譜譜圖的變化，結果如圖5所示。使用Plus-C18色譜柱時，主峰的峰形較好，主峰后出現(xiàn)其余色譜柱上未出現(xiàn)的雜質峰，見圖5(a)；當流動相比例為74∶26時，雜質與主峰完全分離，其余雜質分離效果較好，見圖5(b)；在261 nm的紫外吸收波長下，6.5 min和12.5 min的雜質響應最充分，雜質的峰面積最大，見圖5(c)；當樣品濃度為500 mg/L及以上時，雜質1、2、3出峰明顯，響應充分，見圖5(d)。最后確定染料木素的液相色譜條件為：定值波長261 nm，色譜柱Eclipse Agilent Plus-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相比例74∶26，樣品濃度500 mg/L。

2.4.2 質量平衡法定值結果 樣品實際純度等于HPLC-UV法測得的純度減去水分含量、揮發(fā)性雜質含量、以及無機元素含量等，最終質量平衡法定值結果如表4所示，其中無機元素含量較少可以忽略。所以由質量平衡法(MB)測定的染料木素純度為99.58%。

2.5 核磁共振氫譜法定值

2.5.1 定量峰選擇 通過分析苯甲酸和染料木素混標的核磁氫譜圖，可以確定苯甲酸與染料木素混合樣品中的各個質子峰的歸屬，并且可以確定每個質子峰對應的質子數。染料木素A位的質子峰與苯甲酸B位的質子峰，化學位移值接近，耦合裂分簡單，不受其他質子峰干擾，可以當作定量峰(圖6)進行定值研究。

2.5.2 核磁氫譜法定值結果 核磁氫譜法定值檢測結果如表5所示。

2.6 純度定值結果

純度定值的結果取質量平衡法與定量核磁法測量結果的平均值，計算公式如式(1)所示，計算結果保留一位有效數字，為99.6%。

(1)

2.7 不確定度評定

染料木素純度標準物質研制過程中的不確定度評估根據標準物質定值通用原則[26]17-23進行，主要由均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗和定值過程3部分組成[27]。

2.7.1 均勻性引入的不確定度 均勻性標準偏差計算公式如式(2)所示。

(2)

式中：

SH——均勻性標準偏差；

n——組內測量次數；

v2——組間自由度。

圖5 染料木素液相條件優(yōu)化圖Figure 5 The optimal conditions of HPLC of Genistein

表4 染料木素的質量平衡法定值結果Table 4 The results of MB of Genistein %

(3)

2.7.2 穩(wěn)定性引入的不確定度 長期穩(wěn)定性的相對不確定度ults, rel根據表2的數據進行計算，計算公式如式(4)所示，結算結果為0.000 8%。

圖6 苯甲酸及染料木素的1H-NMR譜圖

Figure 61H-NMR spectrum of benzoic acid

and genistein

(4)

短期穩(wěn)定性引入的相對不確定度usts,rel根據表3的數據進行計算，計算公式：

(5)

表5 染料木素純度標準物質質量分數核磁結果

Table 5 Nuclear magnetic resonance results of genistein purity reference materials %

研究選擇不同溫度條件下不確定度最大的作為短期穩(wěn)定性的不確定度，所以應選溫度條件為20 ℃下檢測引入的不確定度為短期穩(wěn)定性的不確定度，計算公式如式(6)所示，計算結果為0.022 5%。

(6)

2.7.3 定值引入的不確定度 定值引入的不確定度由質量平衡法和定量核磁法兩部分構成，計算公式如式(7)所示，計算結果為0.11%。

(7)

(1) 質量平衡法引入的不確定度：質量平衡法引入的相對標準不確定度計算公式如式(8)所示，計算結果為0.053%。

u(PMB,rel)=

(8)

式中：

u(P0)——HPLC法測定合成不確定度，%；

u(Xw)——微量水分測定引入的不確定度，%；

u(Xw)——非揮發(fā)性雜質測定引入的不確定度，%；

u(Xv)——揮發(fā)性雜質測定引入的不確定度，%。

質量平衡法測定染料木素引入的相對標準不確定度見表6。

表6 質量平衡法測定染料木素引入的相對標準不確定度

Table 6 Relevant standard uncertainty results ofthedeterminationofGenisteinby massbalance

名稱計算結果/%u(Po)0.05u(Xw)0.018u(Xn)NDu(Xv)ND

(2) 定量核磁法引入的不確定度：定量核磁法引入的相對不確定度計算公式如式(9)所示，計算結果為0.086%。

(9)

式中：

u(Ix/Istd)——積分面積測定引入的不確定度，%；

u(Mx)——染料木素分子量引入的不確定度，%；

u(Mstd)——苯甲酸分子量引入的不確定度，%；

表7 定量核磁法測定染料木素引入的相對標準不確定度

Table 7 Relevant standard uncertainty results of the determination of Genistein by qNMR

名稱計算結果/%u(Ix/Istd)0.054u(Mx)0.006 99u(Mstd)0.003 26u(mx)0.000 6u(mstd)0.000 6u(Pstd)0.01

u(mx)——樣品天平稱量引入的不確定度，%；

u(mstd)——內標物天平稱量引入的不確定度，%；

u(Pstd)——內標物純度引入的不確定度，%。

定量核磁法測定染料木素引入的相對標準不確定度見表7。

2.7.4 合成及拓展不確定度 染料木素純度標準物質的相對不確定度計算公式如式(10)所示，計算結果為0.018 3%。

(10)

擴展不確定度為：UCRM=k×p×uc,rel≈0.4%(k=2)。

3 結論

研究對市售的染料木素樣品進行了定性分析，并對樣品進行了均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察，建立了一種以液相色譜法(HPLC)為基礎的染料木素的定值方法，同時用定量核磁法進行純度驗證，最終確定該染料木素純度標準物質的純度為99.6%，拓展不確定度為0.4%。