張 晶 劉雙平 - 周志磊 - 毛 健

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

傳統(tǒng)黃酒釀造是以糯米、麥曲等為原輔料，經(jīng)酵母、細菌、霉菌等微生物共同作用釀造而成的發(fā)酵原酒。“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色，麥曲在黃酒釀造過程中至關(guān)重要，可作為黃酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑，被稱為“酒之骨”[1-2]。麥曲是在破碎的小麥粒上培養(yǎng)繁殖微生物而制成的黃酒生產(chǎn)用糖化劑和發(fā)酵劑[3]。它可以為黃酒釀造提供豐富的酶類，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，這些酶類可以分解原料中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等高分子物質(zhì)；而在制曲過程中形成的各種代謝產(chǎn)物，以及由這些代謝產(chǎn)物相互作用產(chǎn)生的色澤、香味等，則可以賦予黃酒酒體獨特的風格[4-5]。

近年來，酶制劑因其高效能在發(fā)酵工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[6]。應(yīng)用于黃酒釀造中的酶制劑主要有糖化酶、酸性蛋白酶、耐高溫α-淀粉酶等[7]。目前中國對于酶制劑的應(yīng)用主要集中在添加酶制劑輔助麥曲，提高發(fā)酵原料利用率和降低出糟，以及酶制劑對黃酒風味的影響方面，而酶制劑對黃酒發(fā)酵過程的影響等相關(guān)報道尚無。

試驗擬通過添加不同比例的麥曲或商業(yè)酶制劑進行傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵，跟蹤測定黃酒發(fā)酵過程中理化指標的變化，并利用高效液相色譜(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析不同發(fā)酵黃酒的主要風味物質(zhì)組成，探究麥曲添加量對黃酒發(fā)酵過程的影響規(guī)律。以期進一步認識麥曲在黃酒釀造中的作用，為黃酒的實際生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥曲和釀酒酵母：浙江省紹興市黃酒廠；

糯米：無錫糧油中心批發(fā)市場；

3,5-二硝基水楊酸、NaOH、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

2-辛醇、甲醇、乙腈、氨基酸和有機酸等標品：色譜純，安譜實驗科技股份有限公司；

酶制劑(糖化酶)：1×105U/mL，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)：Waters e2695型，美國Waters科技有限公司；

萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS型，美國Supelco公司；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Fisher TRACE 1300型，美國Thermo Fisher科技公司；

水浴恒溫振蕩器：DSHZ-300A型，太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；

全自動立式蒸汽滅菌器：CT88A型，馳通儀器(上海)有限公司；

pH計：FE28型，瑞士Mettler Toledo公司；

紫外可見光分光光度計：UV-1800型，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵 參照紹興某酒廠黃酒發(fā)酵工藝，在其他條件不變的情況下，采用單因素試驗，發(fā)酵投料時控制麥曲添加量分別為5%，8%，12%，16%(以麥曲占原料米的比例計)，研究麥曲添加量對黃酒發(fā)酵過程及風味的影響，各樣品分別命名為5% WQ、8% WQ、12% WQ和16% WQ；試驗中同時采用商業(yè)酶制劑(糖化酶，該發(fā)酵樣品命名為0% WQ+Enzyme)代替麥曲進行發(fā)酵，并與傳統(tǒng)釀造工藝發(fā)酵結(jié)果進行對比。

分別在發(fā)酵時間為1，2，3，4，7，10，14，23 d時取樣，檢測發(fā)酵液的理化指標、游離氨基酸、有機酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)含量。

1.3.2 理化指標的測定

(1) 總酸、pH、酒精度、氨基酸態(tài)氮：按GB/T 13662—2018執(zhí)行。

(2) 還原糖：采用-3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[8]。

1.3.3 有機酸和游離氨基酸含量的測定

(1) 黃酒發(fā)酵醪中有機酸含量：采用HPLC法[9]。

(2) 游離氨基酸：按GB/T 13662—2018執(zhí)行。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

(1) 揮發(fā)性風味物質(zhì)：采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合GC-MS的方法測定發(fā)酵樣品中的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量，測定方法參照文獻[10]。

(2) 樣品前處理：取1.5 mL發(fā)酵液，加入4.5 mL去離子水，2.5 g氯化鈉以及10 μL內(nèi)標溶液(2-辛醇，101.8 mg/L)，于50 ℃下使用50/30 μm DVB-CAR-PDMS固相微萃取頭平衡吸附50 min，270 ℃解吸6 min，用于GC-MS測定。

(3) 物質(zhì)定性和定量分析：采用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合標準物質(zhì)進行定性分析，有標樣的物質(zhì)采用標準曲線定量，沒有標樣的物質(zhì)以內(nèi)標面積為參照進行半定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Microsoft Office Excel 2016、SPSS statistics 22.0、GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果采用(平均值±標準差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒發(fā)酵過程中理化指標的變化

2.1.1 麥曲添加量對黃酒發(fā)酵過程中酒精度的影響 如圖1所示，發(fā)酵前期(0～4 d)，酒精度與麥曲的添加量呈正相關(guān)，即麥曲添加量越多，其產(chǎn)酒精的速率越快；發(fā)酵后期(4～23 d)，不同樣品的酒精度呈緩慢上升趨勢，至發(fā)酵結(jié)束除樣品0% WQ+Enzyme酒精度只有12.5% vol外，其余樣品的酒精度均達到較高水平。其中，樣品5% WQ的酒精度最高，達18.8%vol，而添加麥曲最多的樣品16%WQ的酒精度最低為17.1%vol。發(fā)酵前期，麥曲添加量越多的樣品的起始發(fā)酵速度更快，可能是由于麥曲中有大量的微生物和酶，而麥曲添加量多的樣品發(fā)酵液中的糖化酶含量也較多，可以更快地將原料中的淀粉分解為可發(fā)酵糖；同時大量的微生物快速繁殖后，能夠分泌更多的糖化酶；但發(fā)酵后期，由于微生物更多，其較多的糖類用于微生物的生長代謝，而麥曲添加量少的樣品的微生物生長消耗的糖類也較少，更多的糖可用于酒精的轉(zhuǎn)化。而添加商業(yè)酶制劑的樣品(0% WQ+Enzyme)，可能由于缺少由麥曲帶入的部分微生物，其發(fā)酵速度慢，酒精度低。

圖1 黃酒發(fā)酵過程中酒精度的變化

Figure 1 Changes in alcohol content during huangjiu fermentation

2.1.2 麥曲添加量對黃酒發(fā)酵過程中還原糖的影響 如圖2所示，隨發(fā)酵的進行，樣品中的還原糖含量快速降低，前發(fā)酵結(jié)束(4 d)時添加麥曲的樣品的還原糖含量均降至40 g/L以下，發(fā)酵結(jié)束(23 d)時樣品5% WQ、8% WQ、12% WQ和16% WQ中的還原糖分別降至1.64，1.46，1.31，1.68 g/L，已基本消耗殆盡。而樣品0% WQ+Enzyme中的還原糖含量在發(fā)酵前期先上升后下降，但一直保持在150 g/L以上，說明添加的糖化酶充分發(fā)揮了糖化作用，但是釀酒酵母將糖轉(zhuǎn)化為酒精的轉(zhuǎn)化速率較慢，發(fā)酵結(jié)束時樣品中仍有64.04 g/L的還原糖未完成轉(zhuǎn)化。這可能由于商業(yè)酶制劑糖化效率較高，快速糖化產(chǎn)生了大量的還原糖，過高的糖濃度抑制了酵母的生長和代謝而導(dǎo)致。因此，麥曲在黃酒發(fā)酵中不僅作為糖化劑，還可以促進酵母的生長代謝[11]。

圖2 黃酒發(fā)酵過程中還原糖含量的變化

Figure 2 Changes in reducing sugar content during huangjiu fermentation

2.1.3 麥曲添加量對黃酒發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的影響

如圖3所示，添加麥曲的樣品中的氨基酸態(tài)氮呈動態(tài)上升的趨勢，發(fā)酵結(jié)束(23 d)時各樣品的含量為0.26～0.44 g/L，均符合GB/T 13662—2018《黃酒》標準。氨基酸態(tài)氮在發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是：蛋白酶不斷的水解原料中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生低分子肽和氨基酸等，使氨基酸態(tài)氮的含量上升，同時酵母、霉菌等微生物又將這些肽類和氨基酸作為營養(yǎng)物質(zhì)而消耗掉，使得樣品中氨基酸態(tài)氮的含量下降，發(fā)酵后期在酒精等因素作用下酵母等微生物發(fā)生自溶，內(nèi)容物析出，使得氨基態(tài)氮的含量再次增加。氨基酸態(tài)氮的含量與麥曲的添加量呈正相關(guān)，可能有兩個原因：① 麥曲中富含蛋白酶，麥曲添加量越多，蛋白酶含量也越多，水解原料中的蛋白產(chǎn)生的氨基酸也就越多；② 小麥中的蛋白含量高于釀酒糯米中的蛋白含量[12]，添加越多的麥曲，也相當于添加了較多的蛋白質(zhì)。樣品0% WQ+Enzyme中氨基酸態(tài)氮的含量一直在較低水平，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵醪中的氨基酸態(tài)含量僅為0.08 g/L。這可能是因為發(fā)酵醪中缺少蛋白酶，無法將原料中的氨基酸釋放出來。

圖3 黃酒發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

Figure 3 Changes in amino acid nitrogen content during huangjiu fermentation

2.1.4 麥曲添加量對黃酒發(fā)酵過程中pH和總酸的影響

如圖4(a)所示，發(fā)酵過程中樣品的pH處于波動狀態(tài)，發(fā)酵結(jié)束時各樣品的pH值在3.96～4.35，符合GB/T 13662—2018《黃酒》標準。如圖4(b)所示，隨發(fā)酵的進行，樣品中總酸含量呈先快速上升，然后波動變化的狀態(tài)。發(fā)酵結(jié)束時添加麥曲發(fā)酵樣品的總酸含量為4.52～5.84 g/L，符合GB/T 13662—2018《黃酒》標準；而樣品0% WQ+Enzyme中的有機酸含量較低，僅為3.32 g/L。發(fā)酵初期，麥曲添加量越多樣品的總酸含量增加越快，且增速明顯高于樣品0% WQ+Enzyme；發(fā)酵結(jié)束樣品中總酸含量與麥曲添加量呈正相關(guān)。推測可能是因為麥曲添加量越多的樣品帶入了越多的微生物，尤其是產(chǎn)酸的細菌等，這些微生物隨發(fā)酵的進行大量繁殖，代謝產(chǎn)生較多的酸[13-14]。樣品0% WQ+Enzyme發(fā)酵結(jié)束的總酸含量為3.32 g/L，是發(fā)酵初期(1 d)的1.5倍，可能是因為該樣品以酵母菌為優(yōu)勢菌，其代謝產(chǎn)生的酸類物質(zhì)較少的原因。

2.2 麥曲添加量對黃酒風味的影響

2.2.1 有機酸 有機酸不僅是黃酒中重要的呈香、呈味物質(zhì)，還是許多重要風味物質(zhì)的前體。它可以降低黃酒的甜度，緩沖、協(xié)調(diào)其他香味成分，增強黃酒的醇厚感，延長回味時間[15]。黃酒中的有機酸主要是由發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生，也有部分來自于原料帶入或勾兌調(diào)酸等。有機酸含量少使得酒味單調(diào)、寡淡，短口，而有機酸含量過高使得酒味酸、刺舌，粗糙，只有有機酸的含量適當才能使黃酒清爽利口，醇滑綿柔[16]。如圖5所示，黃酒中有機酸含量隨麥曲添加量的增加而顯著增加，其中乳酸、蘋果酸、酒石酸和乙酸的含量增加最為明顯。麥曲添加量為16%的樣品的有機酸總量分別是麥曲添加量為5%，8%，12%的樣品的1.85，1.37和1.19倍，是添加復(fù)合酶(0% WQ+Enzyme)樣品的4.57倍。而樣品0% WQ+Enzyme中有機酸含量只有1 285.87 mg/L，顯著低于其他樣品。說明黃酒中的有機酸主要是由麥曲帶入的其他微生物如霉菌和細菌等代謝產(chǎn)生，而麥曲添加量越多的發(fā)酵樣品中微生物豐度越高，由微生物代謝產(chǎn)生的酸也就越多?？梢婝溓奶砑訉S酒中有機酸的影響很大，會影響黃酒風味。

圖4 黃酒發(fā)酵過程中pH值和總酸含量的變化

Figure 4 Changes in pH and total acid content during huangjiu fermentation

圖5 不同麥曲添加量下黃酒中的有機酸含量

Figure 5 Contents of organic acid in huangjiu brewed with different quantity of wheat qu

2.2.2 游離氨基酸 氨基酸是黃酒中重要的風味物質(zhì)，不同的氨基酸可以呈現(xiàn)出不同的味道，如甜味、澀味、鮮味和苦味等。氨基酸可以賦予黃酒較高的營養(yǎng)保健功能和誘人的醇香，是黃酒色澤的重要來源，還可以為發(fā)酵中微生物的生長繁殖提供豐富的氮源[17]。由表1可以看出，不同發(fā)酵樣品中游離氨基酸的總量與麥曲添加量呈正相關(guān)，與氨基酸態(tài)氮的測定結(jié)果一致。不同氨基酸的增加量區(qū)別較大，其中絲氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸的含量提高較明顯，樣品16% WQ中的含量比樣品5%WQ的分別提高了191.26%，178.99%，156.48%，而精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸的含量提高較少，分別為77.82%，72.97%，65.81%。這可能與黃酒的釀造原料中蛋白質(zhì)的組成有關(guān)，蛋白質(zhì)本身含有的氨基酸的含量和種類決定了其水解后黃酒中氨基酸的種類和數(shù)量。麥曲的添加既可以提供更多的蛋白質(zhì)，同時麥曲中的蛋白酶也使得原料中蛋白質(zhì)水解更為徹底。麥曲添加量為16%的樣品中游離氨基酸總量為3 537.02 mg/L，是樣品0% WQ+Enzyme的12.72倍，故麥曲的添加對氨基酸的含量影響顯著，會影響黃酒的風味。

2.2.3 揮發(fā)性風味物質(zhì) 黃酒所具有的獨特香氣，不是指某單一化合物的香氣，而是由醇類、酯類、酸類、醛類、酚類和羰基化合物等多種成分所構(gòu)成的，這些風味物質(zhì)雖然含量低，但是呈香效果顯著[18-20]。由圖6可知，樣品16% WQ的揮發(fā)性化合物含量最高，達4.83 mg/L，分別是樣品12% WQ、8% WQ、5% WQ和0% WQ+Enzyme的1.02，1.20，1.24，1.77倍。由此可見，麥曲添加量對黃酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量影響顯著，其總量與麥曲添加量呈正相關(guān)。其中樣品16% WQ和12% WQ，樣品8% WQ和5% WQ的揮發(fā)性風味物質(zhì)的總量無顯著性差異，這一結(jié)果可以用于指導(dǎo)實際生產(chǎn)中減少麥曲添加量，降低生產(chǎn)成本。所有樣品風味物質(zhì)均以醇類、酯類和酸類為主。其中，酸類、酯類、醇類和酚類物質(zhì)含量隨麥曲添加量的增加上升明顯，而醛類物質(zhì)含量變化不大。醇類物質(zhì)可以直接通過糖發(fā)酵或氨基酸代謝產(chǎn)生，因此其含量與發(fā)酵液中的可發(fā)酵糖和氨基酸含量有很大關(guān)系，而麥曲添加量越多的樣品中氨基酸含量越多，因此麥曲的添加有利于醇類物質(zhì)的合成。醇類和酸類含量的增多，也會促進酯類物質(zhì)的合成。麥曲中復(fù)雜的微生物菌群，尤其是產(chǎn)酸菌的作用，有助于酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，這一結(jié)果在總酸和有機酸指標的測定中也得到了驗證。酚類物質(zhì)主要有愈創(chuàng)木酚、苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等，其含量偏低，有研究[21]表明黃酒中的酚類物質(zhì)主要來源于麥曲，因此，麥曲的添加可以提高黃酒中酚類物質(zhì)含量。樣品0% WQ+Enzyme中的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類少，且含量低，可能有3個原因：① 缺少麥曲來源的微生物的生長代謝產(chǎn)生的風味物質(zhì)；② 麥曲本身可以提供少量的風味物質(zhì)；③ 麥曲作為原料，可以為風味物質(zhì)合成提供前體物質(zhì)。

表1 不同麥曲添加量釀造黃酒的17種游離氨基酸含量

Table 1 Contents of 17 free amino acids in huangjiu brewed with different quantity of wheat qu mg/L

樣品天冬氨酸谷氨酸絲氨酸組氨酸甘氨酸蘇氨酸0%WQ+Enzyme21.32±0.3037.14±0.444.79±0.112.14±0.005.20±0.0010.64±0.315% WQ63.88±1.02159.72±1.6933.87±0.5346.29±1.6353.18±0.9260.96±2.738% WQ102.57±21.3207.56±15.4652.19±8.0271.20±5.8378.61±10.7685.05±7.2812% WQ136.60±5.67247.41±1.3270.13±3.3383.93±1.4593.94±2.98103.85±3.6416% WQ178.22±2.95305.23±9.1598.65±2.08104.32±2.78122.94±4.35127.65±3.34樣品精氨酸丙氨酸酪氨酸半胱氨酸纈氨酸甲硫氨酸0%WQ+Enzyme34.04±3.1018.29±0.2923.09±0.190.64±0.0311.13±0.1511.88±0.125% WQ315.46±3.32126.21±0.94133.74±1.674.78±0.1792.42±0.7933.58±0.988% WQ406.64±54.67177.70±14.42170.54±20.326.02±1.21120.00±20.6446.16±2.8112% WQ457.73±3.36234.54±4.06194.45±3.768.27±0.87141.70±3.0562.27±0.4316% WQ560.96±28.28301.21±3.11257.32±6.9812.26±0.63192.61±10.6278.10±2.28樣品苯丙氨酸異亮氨酸亮氨酸賴氨酸脯氨酸總量0%WQ+Enzyme31.88±1.287.11±0.1028.28±0.5915.41±1.9715.54±4.59278.01±6.435% WQ158.81±1.6169.81±0.09161.40±0.34122.14±0.70106.47±3.111 742.74±13.088% WQ190.35±27.3088.09±14.51210.34±29.67161.82±13.95143.42±31.532 318.27±299.7012% WQ210.47±2.14100.91±1.33253.85±4.11189.29±2.37205.40±6.502 794.72±36.6516% WQ263.33±11.47130.45±5.99328.7±11.49211.27±1.50263.79±2.753 537.02±109.76

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖6 不同麥曲添加量釀造黃酒中的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量

Figure 6 Contents of volatile flavor compounds in huangjiu brewed with different quantity of wheat qu

3 結(jié)論

研究通過添加不同比例的麥曲或商業(yè)酶制劑進行傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵，跟蹤測定了黃酒發(fā)酵過程中理化指標的變化，并利用高效液相色譜(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析了不同發(fā)酵黃酒的主要風味物質(zhì)組成。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麥曲的添加量與總酸、氨基酸態(tài)氮、有機酸、游離氨基酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)含量呈正相關(guān)，但對pH值和還原糖含量的影響不大。對酶制劑發(fā)酵和麥曲發(fā)酵樣品進行對比分析，發(fā)現(xiàn)酶制劑發(fā)酵樣品中的氨基酸態(tài)氮、酒精度、有機酸、游離氨基酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量顯著低于麥曲發(fā)酵樣品的，且發(fā)酵結(jié)束樣品中還原糖含量較高，樣品未發(fā)酵完全。表明麥曲對于黃酒的釀造和風味更為有利。麥曲的用量和質(zhì)量直接影響到黃酒的質(zhì)量和產(chǎn)量，而且對黃酒的風味有重要作用。研究主要著重于分析麥曲添加量對黃酒發(fā)酵過程和風味的影響，后續(xù)可以進一步研究麥曲中酶活力、微生物和風味等因素對黃酒質(zhì)量的影響。