龍安雨，田輝伍，汪登強，陳大慶，周湖海,3，段辛斌

(1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，武漢 430223；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

長江上游指宜昌以上江段，該江段地形地貌復(fù)雜、河流水系眾多，魚類區(qū)系與物種組成具有多樣性、特有性特征，有魚類200多種，其中特有魚類100多種[1]。近年來，隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展，該江段大型水利工程相繼建設(shè)，導(dǎo)致水文等環(huán)境條件發(fā)生改變，魚類適宜生境不斷破碎、萎縮，種群數(shù)量急劇下降[1]，魚類資源和遺傳多樣性保護已成為長江上游水電開發(fā)過程中受關(guān)注的熱點之一。

中華金沙鰍(Jinshaiasinensis)和短身金沙鰍(J.abbreviata)是長江上游的特有魚類，是金沙鰍屬僅有的兩個種[2]，其中中華金沙鰍也是“長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區(qū)”的保護對象之一[3]。兩種金沙鰍均為底棲、雜食性、喜激流、產(chǎn)漂流性卵魚類，其生活類型是長江上游最主要的生態(tài)類群，具有代表性。兩種金沙鰍不僅有相似的形態(tài)特征和生活習(xí)性，而且分布區(qū)域基本重疊，主要分布在長江上游干流、金沙江、雅礱江、嘉陵江和岷江[2,4]等水域。但是在資源量上，中華金沙鰍和短身金沙鰍有明顯差別，根據(jù)魚類早期資源調(diào)查，中華金沙鰍規(guī)模大于短身金沙鰍[4]，表明這兩種魚對環(huán)境的適應(yīng)力存在差異。因此研究群體遺傳多樣性有助于闡明近緣同域分布種類的適應(yīng)性進化。本研究采用線粒體DNA (mtDNA)控制區(qū)序列對長江上游兩種金沙鰍遺傳多樣性進行分析，旨在了解兩種金沙鰍的遺傳多樣性現(xiàn)狀，為長江上游金沙鰍屬魚類的資源保護提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016-2018年在長江上游8個樣點采集中華金沙鰍136尾，3個樣點采集短身金沙鰍66尾。樣本采集地見圖1，樣本量見表1。所有樣本經(jīng)形態(tài)鑒定[2]后剪取少量鰭條并保存于無水乙醇中備用。

圖1 中華金沙鰍和短身金沙鰍采樣點及中華金沙鰍線粒體DNA控制區(qū)譜系分布Fig.1 Sampling sites and mtDNA clad distribution of J.sinensis and J.abbreviate

1.2 基因組DNA 提取、PCR 擴增及測序

采用高鹽法提取基因組DNA[5]。線粒體控制區(qū)PCR擴增采用申紹祎等[6]研究所用引物。PCR的擴增體系為50 μL，包含2×PCR Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)25 μL，上下游引物(10 pmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水加至50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。PCR結(jié)束后，取2.5 μL產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR，將擴增效果良好的PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠生物科技有限公司進行雙向測序，測序引物與PCR引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

使用Lasergene v7.1軟件包中的SeqMan對雙向測序結(jié)果進行序列拼接，Clustal X[7]軟件進行對位排列。用 MEGA v6.0[8]分析軟件統(tǒng)計序列的平均堿基組成、計算轉(zhuǎn)換/顛換比率。在DnaSP v5.0[9]軟件中獲得單倍型數(shù)(H)、變異位點數(shù)(S)、簡約信息位點數(shù)，計算單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)等參數(shù)，并計算群體間的K2P遺傳距離，。

應(yīng)用Arlequin v3.11[10]軟件計算群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)值，進行分子方差分析(AMOVA)，設(shè)1 000次重復(fù)隨機抽樣作顯著性檢驗。用公式Nm=(0.5/FST)-0.5計算群體間基因流[11]。在MEGA v6.0[7]分析軟件中構(gòu)建單倍型鄰接(NJ)發(fā)育樹，bootstrap驗證各分支支持率，設(shè)置為1 000。同時采用MrBayes v 3.1.2[12]軟件對單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)生樹進行了貝葉斯推理(BI)，最佳堿基替換模型由在線軟件IQtree (http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/)獲得。使用Network5.0程序[13]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，對單倍型進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行分析。

在DnaSP v5.0軟件中計算中性檢驗值Tajima′s D和Fu′s Fs。用Beast 2.4.3.0[14]進行Bayesian Skyline Plots (BSP)分析種群歷史，MCMC設(shè)為600 000 000，所得結(jié)果由TRACER ver.1.4 讀取，各項參數(shù)的ESS均大于200。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異

序列比對后共獲得中華金沙鰍136條控制區(qū)序列，有效序列長度為915 bp，A、T、C、G的平均含量為35.63%、30.19%、20.02%和14.15%，具有明顯的反G含量傾向，Ts/Tv =23.63，轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù)。共獲得66尾短身金沙鰍控制區(qū)序列，比對后得到有效長度為908 bp，A、T、C、G的平均含量為35.82%、31.39%、19.49%和13.30%，Ts/Tv =12.87，轉(zhuǎn)換數(shù)也明顯高于顛換數(shù)。

中華金沙鰍序列中共發(fā)現(xiàn)132個變異位點，其中39個為單一突變位點，93個為簡約信息位點。136條序列共定義了131個單倍型，其中頻率在2以上的單倍型只有5個，其余單倍型的頻率均為1。總樣本核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)分別為0.018 2和0.999(表1)，各群體之間的遺傳多樣性差別較小。短身金沙鰍序列僅檢測到2個變異位點，定義了3個單倍型，Pi和Hd分別為0.000 5和0.411(表1)。

表1 中華金沙鰍和短身金沙鰍采樣點、樣本量、遺傳多樣性及中性檢驗值Tab.1 Sampling sites，sample size，genetic diversity parameters and neutral test of J.sinensis and J.abbreviate populations

注：*表示顯著性檢驗P<0.05，**表示顯著性檢驗P<0.01。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

基于K2P模型計算，中華金沙鰍種內(nèi)單倍型之間的遺傳距離為0.001 1～0.039 6，短身金沙鰍種內(nèi)單倍型之間的遺傳距離為0.001 1～0.002 2，這兩種魚種間的遺傳距離為0.035 7～0.051 5。

中華金沙鰍群體間分子變異方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示，來自群體間遺傳變異組成占-0.75%，來自群體內(nèi)的變異組成占100.75%，群體總的遺傳分化指數(shù)(FST)為-0.007 53，說明中華金沙鰍群體遺傳變異主要來自群體內(nèi)，群體間未出現(xiàn)顯著遺傳分化(表2)。

短身金沙鰍群體間AMOVA分析結(jié)果也顯示群體間未發(fā)生顯著遺傳分化，其變異主要來源于群體內(nèi)(98.72%)，且FST< 0.05 (FST=0.012 78)(表2)。

分別計算兩兩群體間的FST，結(jié)果顯示，中華金沙鰍除NN及QJ與部分群體間的FST值大于0.05外，其余群體間FST均小于0.05(表3)。短身金沙鰍顯示，除BN與HJ群體間FST大于0.05外，其余群體間FST均小于0.05(表4)。

表2 中華金沙鰍和短身金沙鰍群體間分子變異分析Tab.2 Analysis of molecular variance (AMOVA)among populations of J.sinensis and J.abbreviata

中華金沙鰍和短身金沙鰍群體間基因流分別見表3和表4。這兩種魚群體間的Nm值(或絕對值)均大于4(除JJ與NN、BN與HJ外)表明群體間基因交流比較頻繁。

利用Median Joining方法構(gòu)建中華金沙鰍單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(圖2)，可見單倍型關(guān)系復(fù)雜，無明顯的中心單倍型。根據(jù)連接單倍型之間的突變步長，可將單倍型劃分為3個譜系：Clad I、Clad II、

表3 中華金沙鰍群體間的遺傳分化(對角線下方)和基因流Nm值(對角線上方)Tab.3 Pairwise FST (below diagonal)and Nm values (above diagonal)among populations of J.sinensis

表4 短身金沙鰍種群間的遺傳分化(對角線下方)和基因流Nm值(對角線上方)Tab.4 Pairwise FST (below diagonal)and Nm values (above diagonal)among populations of J.abbreviata

Clad III譜系間的步長為10和11，譜系內(nèi)相鄰單倍型之間突變步長都低于10(除了Clad II內(nèi)的一個單倍型)。以犁頭鰍(Lepturichthysfimbriata，GenBank登錄號：DQ105283.1)作為外類群，構(gòu)建兩種金沙鰍單倍型NJ樹和BI樹(圖3)。兩棵樹顯示相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，中華金沙鰍和短身金沙鰍的單倍型分為兩個獨立分支，形成兩個單系群。中華金沙鰍的單倍型又分為3個具有較高支持率的支系。這3個支系包含的單倍型與中華金沙鰍的Network網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)一致。

2.3 種群歷史

通過中性檢驗Tajima′s D和Fu′s Fs等方法分析種群歷史[15]，中華金沙鰍結(jié)果顯示，總?cè)后w以及3個譜系群體的Tajima′s D值均不顯著，而Fu′s Fs檢驗中均為極顯著負(fù)值(表1)。Bayesian skyline plot (BSP)進一步分析表明(圖4)，中華金沙鰍總?cè)后w和3個譜系群體的擴張時間分別約在距今0.12～0.17、0.1～0.12和0.12～0.17百萬年(Ma)。短身金沙鰍群體由于序列變異位點和單倍型數(shù)量少，不作種群歷史分析。

圖2 基于線粒體DNA控制區(qū)序列構(gòu)建的中華金沙鰍單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(短線代表增加一個突變步驟)Fig.2 Haplotype network of J.sinensis based on mtDNA control region sequences

圖3 基于線粒體DNA控制區(qū)序列的中華金沙鰍和短身金沙鰍單倍型NJ樹(A)和BI樹(B)(以犁頭鰍作外類群)Fig.3 Haplotype NJ phylogenetic tree (A)and BI phylogenetic tree (B)based on mtDNA control region sequence of J.sinensis and J.abbreviata (L.fimbriata was used as outgroup)

圖4 中華金沙鰍的BSP分析Fig.4 BSP analysis of J.sinensis population

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

本研究顯示，中華金沙鰍具有很高水平的線粒體遺傳多樣性，與Duan等[16]采用微衛(wèi)星標(biāo)記研究的結(jié)果一致，但該研究僅對雅礱江里莊31尾樣本進行了分析，本研究的采樣點和樣本量更為豐富，包含Duan等[16]研究的江段。長江上游已開展的一些鰍科魚類同樣顯示出高水平的遺傳多樣性，如中華沙鰍(Hd=0.986，Pi=0.003 65)[17]、小眼薄鰍(Hd=0.958，Pi=0.004 20)[18]、紅唇薄鰍(Hd=0.907，Pi=0.003 15)[6]、長薄鰍(Hd=0.916，Pi=0.004 50)[19]等，與長江鯉科、鲿科等魚類遺傳多樣性高低不同，高遺傳多樣性可能是長江上游鰍科魚類線粒體DNA共有特征，更快積累變異。但是短身金沙鰍遺傳多樣性水平卻明顯較低，低水平的遺傳多樣性通常是由于近親繁殖或小種群導(dǎo)致[20]。魚類早期資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，金沙江干流、長江上游干流、雅礱江和岷江等均存在中華金沙鰍和短身金沙鰍產(chǎn)卵場，表明它們是同域分布的，但所有產(chǎn)卵場的中華金沙鰍產(chǎn)卵規(guī)模均大于短身金沙鰍[4]，說明短身金沙鰍的種群規(guī)模比中華金沙鰍小。種群小容易近交，發(fā)生遺傳漂變，導(dǎo)致遺傳多樣性降低。

3.2 種間及種群分化

長江大多數(shù)魚類的種類鑒別可以通過DNA條形碼(mtDNACOI基因)成功解決，但中華金沙鰍和短身金沙鰍例外[21]。這兩種魚之間Cytb基因的遺傳距離也很低(Cytb：0.008±0.001)，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上出現(xiàn)種間單倍型嵌套，無法獲得確定的種間區(qū)分[22]。本研究采用線粒體控制區(qū)分析的結(jié)果顯示，兩種金沙鰍的種間單倍型遺傳距離達到0.035以上，雖然與中華金沙鰍種內(nèi)單倍型之間遺傳距離存在部分重疊，但NJ系統(tǒng)發(fā)育樹可以將它們分開(圖3)。這說明線粒體控制區(qū)比COI和Cytb基因?qū)鹕出q種類鑒別具有更高的區(qū)分度，但遺傳距離上仍然沒有明顯種間間隔，也說明了這兩種魚物種分化時間比較晚。

AMOVA分析顯示，中華金沙鰍和短身金沙鰍群體均未發(fā)生地理遺傳分化，可能與其產(chǎn)卵特征有關(guān)。這兩種魚均產(chǎn)漂流性卵，受精卵隨水漂流較長的距離而發(fā)育，成體向各棲息地擴散，促進了不同群體間的基因交流。長江上游一些產(chǎn)漂流性卵魚類的遺傳結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出類似的同質(zhì)性，如長鰭吻鮈[23]和異鰾鰍鮀[24]等。

盡管未檢測到地理遺傳分化，但中華金沙鰍單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示形成了三個具有較高支持率的譜系，表明中華金沙鰍發(fā)生群體內(nèi)遺傳分化。中華金沙鰍這一遺傳結(jié)構(gòu)特征符合Avise等[25]提出的線粒體系統(tǒng)地理學(xué)的第四類模式，即具有弱的同域單倍型譜系分化，但沒有顯著地理分化，是由于缺少長期亞群體隔離和高水平基因流，或群體擴張和單倍型廣泛分布引起。長江上游一些魚類就具有相似的遺傳結(jié)構(gòu)，如小眼薄鰍[18]和異鰾鰍鮀[24]等。短身金沙鰍單倍型沒有出現(xiàn)譜系分化，可能與其單倍型數(shù)少，單倍型間序列差異小有關(guān)。

3.3 種群歷史

BSP分析結(jié)果顯示中華金沙鰍群體在10萬～17萬年前發(fā)生擴張，這一時期剛好是在第四紀(jì)冰期的廬山亞冰期(20萬～23萬年前)與大理亞冰期(1萬～11萬年前)之間的間冰期，間冰期相對于冰期溫暖[26]，有利于物種生存，也有利于物種從冰期的“避難所”向外擴散，發(fā)生種群擴張。研究表明，長江上游的一些魚類像圓筒吻鮈[27]和銅魚[28]等，也受到冰期影響，其種群在歷史上也發(fā)生過瓶頸和擴張現(xiàn)象。中華金沙鰍在歷史上經(jīng)歷了快速擴張，群體內(nèi)可能積累了大量變異，與其較高的遺傳多樣性結(jié)果相吻合。

3.4 保護建議

本研究發(fā)現(xiàn)兩種金沙鰍均沒有發(fā)生地理遺傳分化，為單一的進化顯著單元，建議就地保護。目前長江上游已經(jīng)建成向家壩和溪洛渡等大型水電工程，正在建設(shè)或規(guī)劃建設(shè)更多梯級水電站，這將使中華金沙鰍和短身金沙鰍等的生境壓縮和碎片化，阻礙群體基因交流。因此，今后還需加強對長江上游兩種金沙鰍等魚類產(chǎn)卵場和遺傳多樣性的監(jiān)測，特別是對群體小、遺傳多樣性較低的短身金沙鰍的監(jiān)測和保護。