申 峰, 閆成金, 李夢麒, 姬德茹, 劉趙淼,2,*

(1. 北京工業(yè)大學 機械工程與應用電子技術學院, 北京 100124; 2. 北京工業(yè)大學 現代工程力學研究所, 北京 100124; 3. 北京工業(yè)大學 先進制造技術北京市重點實驗室, 北京 100124)

0 引 言

微液滴能夠為細胞培養(yǎng)提供獨特的微環(huán)境，具有流體剪應力低、避免細胞間交叉污染、可精確操控微環(huán)境等優(yōu)點[1-3]。近年來，液滴微流控技術已成為細胞培養(yǎng)和生化特性分析的新平臺，在醫(yī)療診斷、新藥物開發(fā)和腫瘤細胞分析等領域顯示了廣泛的應用前景[4-6]。Brouzes等[7]利用液滴微流控技術實現了細胞高通量篩選。Lee等[8]進行了液滴的生成、捕獲與操控研究，并利用液滴包裹和培養(yǎng)細胞。Pan等[9]觀測了微液滴包裹的微藻類細胞隨時間變化的增殖情況。Liu等[10]開發(fā)了一種基于微凹槽結構的微流控芯片裝置，具有低的流體剪應力環(huán)境，可用于細胞的長時間培養(yǎng)。Yu等[11]將包裹細胞的液滴捕獲于微通道特定位置，觀測了多霉素對乳腺癌細胞增殖的影響。

目前，微凹槽內的流場特性對捕獲的液滴內部微環(huán)境有重要影響，已引起了學者關注[12-13]。Shen等[12]開展了顯微粒子圖像測速(Micro-Particle Image Velocimetry，Micro-PIV)實驗，根據結果定義了微凹槽內部的3種流動形式，即附著流、過渡流和分離流。Yew等[13]利用數值模擬和實驗，研究了低雷諾數(Re)下，矩形長凹槽內部流場剪應力和營養(yǎng)物質輸運對凹槽底部細胞培養(yǎng)的影響。研究發(fā)現,凹槽內為附著流時，營養(yǎng)物質能夠到達凹槽底部和細胞進行充分的物質交換，此方法可以模擬細胞在體外培養(yǎng)液中的生存環(huán)境，為細胞培養(yǎng)技術提供參考[14]。Liu等[15]利用Micro-PIV實驗研究了彎曲通道中液滴內部流場，發(fā)現液滴內部存在復雜的渦胞結構，渦胞對液滴內部的剪切變形率有明顯影響。

然而，上述文獻報道的方法需要液滴生成、捕獲、固定等操作步驟，操控過程復雜，且生成的液滴尺寸較小，也不利于長時間的細胞培養(yǎng)。此外，實現液滴內部微環(huán)境的精確調控，尚需深入的流體力學研究，比如，液滴內部的渦胞特性、剪應力分布、流場中培養(yǎng)液流動及輸運特性等。為了精確調控液滴內的微環(huán)境，本文提出了一種基于微通道矩形凹槽生成并封裹液滴的新方法，利用高速顯微攝像系統(tǒng)和Micro-PIV系統(tǒng)，研究了Re對微凹槽內液滴形貌及內部流場速度矢量場特性、剪應力分布的影響。

1 實驗系統(tǒng)及方法

實驗中的微流控芯片如圖1(a)所示，包括直的微通道和位于一側的矩形微凹槽。芯片包含2個入口(1為水相，2為油相)和一個出口。微通道橫截面為矩形，寬度W=200 μm，深度H=100 μm。凹槽寬度固定為Wc=600 μm，長度分別為Lc=600、1200、1800和3000 μm等4種，長寬比分別為e=Lc/Wc=1、2、3和5，深度均為H=100 μm。類似的矩形微凹槽結構在文獻中已有報道[16-18]，而本文中凹槽長寬比更大。芯片材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，利用軟光刻技術制作[12]。實驗發(fā)現，e=1和2時，凹槽內無法生成穩(wěn)定的液滴；e=5時，液滴內部剪應力不均勻；e=3時，凹槽內更容易封裹生成液滴，實驗效果最佳，故本文采用e=3的凹槽。此芯片可在凹槽內部簡便地生成、捕獲、固定液滴。通過調節(jié)微通道入口流量，可精確調控液滴內部微環(huán)境，并且微環(huán)境內剪應力平均值極低，可實現長時間觀測。

實驗中采用高速攝像動態(tài)顯微系統(tǒng)(Keyence，VW-9000)實時觀察液滴形貌變化，利用Micro-PIV系統(tǒng)(Dantec Dynamics)測量液滴內部流場速度矢量場。Micro-PIV系統(tǒng)基本包括：雙脈沖激光器(Nd：YAG，單脈沖最大值135 mJ，波長532 nm)、高靈敏度CCD相機(HiSense MKII，12 bit，1344 pixel×1024 pixel)、同步控制器、Leica倒置顯微鏡、圖像采集處理系統(tǒng)(Dynamic Studio)和三維電動控制平臺(精度為2 μm)等，實物圖如圖1(c)所示。Micro-PIV是一種整場、瞬態(tài)、定量的微流場可視化測量技術，能夠在2個脈沖的瞬間記錄大量示蹤粒子在流場內的分布信息，形成2幅粒子圖像，然后對粒子圖像進行空間相關性分析，最終得到空間流場的速度分布，并可進一步處理得到流線、渦量以及剪應力分布等[12,15]。實驗中觀測液滴的z方向中心平面(z=0～50 μm)，采用的物鏡大倍數為10×，數值孔徑NA為0.25，景深約為18.4 μm。根據拍攝的粒子圖像亮度，設置的激光器的單脈沖強度為75 mJ，CCD幀率為12幀/s，曝光時間根據入口流速不同其調節(jié)范圍為80～800 μs。采用自適應互相關算法(Adaptive Cross-Correlation，ACC)進行圖像處理，判讀區(qū)大小設置為32 pixel×32 pixel (50%疊加)。

采用葵花油(密度ρ=0.918 g/cm3，黏度μ=46 mPa·s，表面張力γ=26.3 mN/m)作為連續(xù)相，去離子水(密度ρ=0.998 g/cm3，黏度μw=1 mPa·s，表面張力γw=72.8 mN/m)作為離散相。連續(xù)相和離散相在PDMS表面的接觸角分別為50.5°和98.7°，兩相界面張力為25.7 mN/m。實驗溫度為20 ℃，實驗過程中，首先在微通道中充滿離散相，然后再以一定的流量通入連續(xù)相，使連續(xù)相對離散相施加一個大于其界面張力的壓力，從而將凹槽內的離散相剪斷，完成液滴的生成及捕獲[16]。采用中性懸浮的聚苯乙烯紅色熒光微球作為示蹤粒子(平均直徑約為0.86 μm、密度約為1.03 g/cm3，激發(fā)波長為532 nm，Duke Scientific)。示蹤粒子添加在離散相溶液中，并添加表面活性劑(Tween 20，0.2%V/V)，以防止示蹤粒子聚集及吸附在微通道壁面，5次疊加的示蹤粒子圖像如圖1(d)所示(Re=16.7)。

圖1 實驗系統(tǒng)

入口流量用雷諾數表征為：

(1)

其中，ρ,μ和U分別為連續(xù)相流體的密度、黏度和在微通道內的平均流速。微通道的水力直徑為：

(2)

液滴內部流場中剪應力計算公式為：

(3)

其中，μw,V和s分別為離散相液滴的黏度、流場速度矢量和相鄰速度矢量間的距離，且τ>0。

2 結果與討論

2.1 雷諾數對微凹槽內液滴形貌的影響

利用高速攝影動態(tài)顯微系統(tǒng)觀察了Re(5.6～55.5)對微凹槽內液滴形貌的影響。隨Re增大，凹槽內液滴面積逐漸減小，液滴形狀也從最初的長條狀開始向圓形轉變，如圖2所示。當Re=11.1時，液滴總長度為1.6 cm，液滴上側與凹槽底部邊緣接觸面積較大，液滴下側兩相界面傾角較大。當Re=22.2時，液滴的長度減小為1.16 mm，液滴上側與凹槽邊緣接觸面積明顯減少，液滴下側兩相界面變?yōu)樽笥覍ΨQ狀態(tài)。當Re=33.3時，液滴長度減小為0.8 mm，為Re=11.1時液滴長度的一半，且液滴形狀更加趨于圓形。Re繼續(xù)增大時液滴面積減小趨勢減弱。此外，微凹槽內生成的液滴形貌長時間保持穩(wěn)定。

推測上述現象的產生是由于PDMS芯片的可變形性所導致的[19]。當Re較大時，微通道內部壓力升高，導致微凹槽在深度方向發(fā)生擴張。從圖2中還可以發(fā)現，隨著Re從11.1增大到33.3，液滴輪廓線形貌逐漸變寬，顏色變深，證明了液滴在深度z方向尺寸逐漸增加。此外，液滴下側界面形貌是由連續(xù)相流動、兩相接觸角和液滴界面張力作用共同決定的。當Re=11.1時，由于微通道內的連續(xù)相流動方向為從右向左，液滴在壓力作用下有被連續(xù)相向左上角擠壓的趨勢，故出現液滴下界面左側明顯大于右側的現象。隨著Re增大，液滴下界面位置上移，連續(xù)相流動作用減弱。同時，隨液滴z方向深度的增加，液滴界面張力和兩相接觸角作用逐漸增強，導致液滴更趨于圓形，液滴更加呈現出三維空間形貌特性。此外，隨Re增大，液滴上側界面與凹槽底部2個角所圍成的區(qū)域內連續(xù)相流體體積不斷增大。

圖2 不同Re下長凹槽內液滴的形貌變化

2.2 雷諾數對微凹槽內液滴流場特性的影響

液滴內部流場特性對細胞培養(yǎng)和營養(yǎng)物質輸運有重要影響，利用Micro-PIV測量了不同Re(5.6～55.5)下微凹槽內液滴內部的速度矢量場特性，結果如圖3所示。Re=5.6時，液滴內部未觀測到渦胞結構，液滴速度最大處位置在液滴下側界面的右側區(qū)域附近，這是因為液滴內部流動是由連續(xù)相流動剪切作用引起的，故兩相界面附近區(qū)域流速值較高，如圖3(a)所示；Re=11.1和33.3時，如圖3(b)和(c)所示，液滴內部有明顯的渦胞結構出現，且Re=11.1時的渦胞尺寸面積較Re=33.3時大，這是由于Re=33.3時的液滴長度減小所致。Re=44.4時，由于液滴面積減小并向微凹槽底部移動，導致液滴內部渦胞結構消失，液滴內部速度分布相對較為均勻，如圖3(d)所示。隨著Re從11.1增大到44.4，液滴內部速度最大值位置向液滴下側中心處移動，且最大速度區(qū)域作用面積減小。此外，根據文獻[15]報道和圖3(d)的流線結果推測，液滴內部流場存在復雜的三維空間渦胞結構。

為得到液滴內部流場在x和y方向的速度分布變化情況，提取了液滴內部x和y方向的速度云圖，分別如圖4(a)和(b)所示。圖4(a)結果表明，除了液滴與連續(xù)相接觸界面位置附近，液滴內部流場在x方向的速度分布與圖3中總速度分布趨勢大致相似，但x方向速度梯度比總速度梯度小，x方向速度相對更加均勻。然而，在y方向上，速度分布變化較明顯，如圖4(b)所示。在Re=11.1和33.3時，液滴內部形成渦胞，渦胞左側y方向相對高速流場區(qū)域較大，可以驅動液滴內部流動形成渦胞。而在Re=5.6和44.4時，渦胞左側y方向高速區(qū)域較小，不足以驅動液滴內部流動形成渦胞。以上結果表明，液滴內部渦胞結構的形成是由于流場y方向速度梯度較大所致。

圖3 Micro-PIV測量的不同Re下液滴內部流線圖及速度云圖

圖4 Micro-PIV測量的不同Re下液滴內部x和y方向的流場及速度云圖

提取了液滴內部渦心豎線位置的速度值，如圖5所示。當Re=16.7和22.2時，液滴內部平均流速隨Re的增大而增大；Re=33.3時，液滴內部平均流速達到最大值，約為10 μm/s；Re=44.4和55.5時，液滴內部平均流速隨Re的增大而減小。結果表明，渦胞產生時，液滴內部平均速度增大，加快了液滴內部的物質輸運。

圖5 提取的不同Re下長凹槽液滴內豎線位置的流速分布

Fig.5 The velocity distributions along the line across the droplet in the long microcavity for differentRe

2.3 雷諾數對液滴內部剪應力分布的影響

剪應力(τ)是影響細胞活性和微環(huán)境的重要因素之一，根據實驗結果提取了不同Re下液滴內部流場剪應力分布云圖,如圖6所示。Re=16.7時，剪應力較大的位置在渦心下側及液滴與連續(xù)相接觸界面附近；隨Re的增大，液滴內部的剪應力分布趨于均勻；當Re=44.4和55.5時，液滴內部渦胞消失，液滴下側出現低剪應力區(qū)。

圖6 不同Re下的長微凹槽液滴內部流場結構及剪應力分布云圖

為了進一步的量化分析，提取了液滴內部渦心豎線位置的剪應力值，如圖7所示。結果表明，液滴內部剪應力值分布整體較為均勻且變化微小，入口Re對液滴內部平均剪應力無明顯影響。同時，液滴內部整體剪應力τ平均值小于1.5×10-4Pa，遠低于細胞活性的剪應力承受值(1.0 Pa)[20]。研究結果表明液滴內部存在較低的剪切力環(huán)境，利于長時間的細胞培養(yǎng)與分析。

圖7 Micro-PIV測量的不同Re下長凹槽內部壓力

3 結 論

本文利用微流控技術在微通道矩形長凹槽內生成固定的液滴，并對其內部流場進行了Micro-PIV測量，研究了不同Re(5.6～55.5)下的液滴形貌特性、內部速度矢量場和剪應力分布的變化。結果表明，長微凹槽可以容易地生成并固定液滴，且隨著Re的增大，液滴面積逐漸減??；同時，在連續(xù)相流動剪切作用下，液滴內部流場出現渦胞結構，渦胞隨Re的增大呈現從無到有再到無的變化規(guī)律；此外，液滴內部剪應力τ較小(平均值<1.5×10-4Pa)，且Re對τ無明顯影響。以上結果表明微凹槽液滴可提供穩(wěn)定、均勻、可精確調控的微環(huán)境，為長時間的細胞培養(yǎng)及分析提供新思路。