林偉雄，魏 梅，鄧李紅，張志鵬，羅宇琴，魯 云

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

王不留行是石竹科植物麥藍菜Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟種子，為我國傳統(tǒng)常用中藥，始載于《神農本草經》，列為上品[1]，具有活血通經、下乳消腫、利尿通淋的功效；主要用于治療經閉、痛經、乳汁不下、淋癥澀痛等癥[2]。研究顯示，王不留行主要化學成分為黃酮苷、生物堿、環(huán)肽類、三萜皂苷類、揮發(fā)油等[3-4]，其中王不留行黃酮苷和刺桐堿是其主要有效成分，具有促進乳汁分泌、保護血管內皮細胞、抗炎、增強免疫和抗肝損傷等藥理作用[5-7]。

王不留行由于種子質地堅硬，有效成分不易煎出，炒法是王不留行自明代開始一直沿用至今的炮制工藝，炒制后的炒王不留行質地松泡利于有效成分煎出且走散力強，長于活血通經、下乳、通淋[8]。近年來，多數學者對王不留行炮制前后的區(qū)別進行了大量的研究，認為炮制后能提高王不留行有效成分水溶出率[5]，但未見對王不留行炒制過程中未爆開白花的僵化現象進行研究，受限于當前生產炒藥技術與設備水平，大生產機炒僵化現象比較常見，僵子入藥對炒王不留行主要指標成分含量和整體功效是否存在影響是個值得探討的話題，本實驗對炒王不留行爆花和僵子飲片水溶性浸出物和主要指標成分含量進行測定和比較，同時結合現代先進UPLC技術，建立王不留行炒制前后UPLC特征圖譜，快速全面比較炒王不留行爆花和僵子飲片的差異性，建立王不留行及其炮制品飲片的更高質量控制方法，更好地指導生產和保證臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(沃特世公司，Waters e2695)；Waters超高效液相色譜儀(沃特世公司，Waters H-class)；TUV檢測器(沃特世公司)；Empower工作站；ME204E型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；XP26型百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Direct 8/16 system型超純水機(默克公司)；KQ5500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

王不留行黃酮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度>99.7%，批號：111853-201704)，刺桐堿對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，純度>98.0%，批號：wkq18012302)。液相用甲醇、乙腈(默克股份有限公司)為色譜級，水為超純水(默克股份有限公司，Mili-Q Direct)，其余試劑為分析純。

王不留行藥材信息詳見表1，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合《中國藥典》2015版一部“王不留行”項下相關規(guī)定。選取其中全國主要產區(qū)河北省的3批王不留行藥材Y18、Y19、Y20，作為炒王不留行爆花和僵子研究用。

2 方法與結果

2.1 樣品炮制

取凈王不留行置炒藥機內，按《中國藥典》2015版清炒法(通則0213)炒至大多數爆開白花，呈類球形爆花狀，表面白色，質松脆，取出，晾涼，篩去灰屑，得“炒王不留行飲片”。根據是否爆開白花將其分為“爆花飲片”和“僵子飲片”。

表1 王不留行藥材來源

2.2 浸出物測定

分別稱取樣品約2 g，以水為溶劑，照《中國藥典》2015版浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定，測定結果見表6。

2.3 王不留行黃酮苷含量測定

2.3.1 色譜條件 Thermo Acclaim C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.3%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，35% A；10～20 min，35%～40% A；20～35 min，40%～50% A)，檢測波長280 nm，進樣量10 μL，流速0.7 mL·min-1，柱溫30 ℃。

2.3.2 對照品溶液制備 取王不留行黃酮苷對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含王不留行黃酮苷0.772 8 mg的儲備液，精密量取儲備液2 mL于10 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含154.556 μg的溶液，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3.4 方法學考察 (1)專屬性試驗。精密吸取王不留行黃酮苷對照品溶液、空白溶劑和“2.3.3”項下供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件測定，結果如圖1所示。

注：A.供試品溶液；B.王不留行黃酮苷對照品；C.空白溶劑

(2)線性關系及范圍。精密量取上述王不留行黃酮苷對照品儲備液10.0、6.0、2.0、1.0、0.5、0.1 mL，分別置10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成7.728、38.639、77.278、154.556、463.667、772.778 μg/mL的對照品溶液，分別按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度為橫坐標(X)，得王不留行黃酮苷回歸方程為Y=8 859X+5 253.8(R2=0.999 9)，表明在濃度為7.728 ～772.778 μg·min-1的范圍內王不留行黃酮苷濃度與峰面積線性關系良好。

表2 王不留行黃酮苷標準曲線考察

(3)精密度試驗。精密吸取王不留行黃酮苷對照品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。計算王不留行黃酮苷峰面積的RSD值為0.45%，表明儀器精密度良好。

(4)穩(wěn)定性試驗。精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、12 h按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算王不留行黃酮苷峰面積的RSD值為0.52%，表明供試品溶液中王不留行黃酮苷在12 h內穩(wěn)定。

(5)重復性試驗。精密稱取同一批樣品6份，按“2.3.3”項下確定的供試品溶液制備方法，分別制備王不留行黃酮苷含量測定供試品溶液6份。按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，結果王不留行黃酮苷含量的RSD值為0.30%，表明該方法重復性良好。

(6)加樣回收率試驗。取已測定含量的王不留行粉末約0.6 g，精密稱定，分別精密加入一定量的王不留行黃酮苷對照品，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液9份。按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算王不留行黃酮苷加樣回收率，結果見表3，平均回收率為99.42%，RSD值為1.35%，表明回收率良好。

表3 王不留行中王不留行黃酮苷加樣回收試驗結果 (n=9)

2.3.5 樣品測定 將3批實驗用生品、爆花和僵子飲片分別按照“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制備相應的供試品溶液，并按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，并計算炮制后爆花和僵子飲片王不留行黃酮苷含量損失情況。結果見表6。

2.4 刺桐堿含量測定

2.4.1 色譜條件 YMC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～5.5 min，10%～15% A；5.5～11 min，15%～30% A；11～16.5 min，30%～70% A；16.5～16.51 min，70%～10% A；16.51～23 min，10% A)，檢測波長219 nm，進樣量1 μL，流速0.35 mL·min-1，柱溫35 ℃。

2.4.2 對照品溶液制備 取刺桐堿對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含刺桐堿0.160 9 mg的儲備液，精密量取儲備液2.5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含40.229 μg的溶液，搖勻，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4.4 方法學考察 (1)專屬性考察。精密吸取刺桐堿對照品溶液、空白溶劑和“2.4.3”項下供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件測定，結果如圖2所示。

(2)線性關系考察。精密量取上述刺桐堿對照品儲備液10.0、5.0、2.5、2.0、1.0、0.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成8.046、16.092、32.183、40.229、81.458、160.916 μg/mL的對照品溶液，分別按照“2.4.1”項下色譜條件依次進樣測定；以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度為橫坐標(X)，得刺桐堿的回歸方程為Y=19 677X-21 603(R2=0.999 7)，表明在濃度為8.046～160.916 μg·min-1范圍內刺桐堿濃度與峰面積線性關系良好。

表4 刺桐堿標準曲線考察

注：A.供試品溶液；B.刺桐堿對照品；C.空白溶劑

(3)精密度試驗。精密吸取刺桐堿對照品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。計算刺桐堿峰面積的RSD值為0.62%，表明儀器精密度良好。

(4)穩(wěn)定性試驗。精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、12 h按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，計算刺桐堿峰面積的RSD值為1.11%，表明供試品溶液中刺桐堿在12 h內穩(wěn)定。

(5)重復性試驗。精密稱取同一批樣品6份，按“2.4.3”項下確定的供試品溶液制備方法，分別制備刺桐堿含量測定供試品溶液6份。按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，結果刺桐堿的含量RSD值為1.06%，表明該方法重復性良好。

(6)加樣回收率試驗。取已測定含量的王不留行粉末約0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的刺桐堿對照品，按“2.4.3”項下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液9份。按“2.4.1”項下色譜條件測定，計算刺桐堿加樣回收率，結果見表5，平均回收率為96.68%，RSD值為2.40%，表明回收率良好。

表5 王不留行中刺桐堿加樣回收試驗結果 (n=9)

2.4.5 樣品測定 將3批實驗用生品、爆花和僵子飲片分別按照“2.4.3”項下供試品溶液制備方法制備相應的供試品溶液，并按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，并計算炮制后爆花和僵子飲片刺桐堿含量損失情況。結果見表6。

表6 王不留行炮制前后變化情況 (%)

注：提高溶出率%=(飲片浸出物均值-生品浸出物均值)/生品浸出物均值×100%；損失率%=(1-飲片含量均值/生品含量均值)×100%。

浸出物結果顯示，炒制后飲片均能明顯增大生品的水溶性浸出物，爆花飲片能提高生品約70%的水溶出率，這也驗證了前人研究結論[5]，而僵子飲片只能提高生品約30%水溶出率，炒制僵化現象會降低合格炒王不留行爆花飲片的水溶出率。王不留行生品、炒制后爆花和僵子飲片的王不留行黃酮苷含量均值分別為0.535%、0.265%、0.357%，刺桐堿含量均值分別為0.116%、0.082%、0.103%。炒制后主要指標成分含量均出現明顯下降，炒制過程中含量不斷損失，爆花飲片中王不留行黃酮苷和刺桐堿含量分別損失50%和29%，而僵子飲片中相應損失33%和11%，炒制后爆花飲片主要指標成分損失率明顯大于僵子飲片。

2.5 特征圖譜測定

2.5.1 特征圖譜建立 取20個批次的王不留行藥材，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”條件測定并記錄色譜圖，分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》(2012A)進行比較分析，如圖3所示，共確定了5個共有特征峰，其中，與對照品對照指認了峰1為刺桐堿，峰2為王不留行黃酮苷。以2號峰王不留行黃酮苷作為參照峰(S峰)，計算各共有特征峰相對保留時間和相對峰面積，按照特征圖譜研究技術的要求，生成王不留行共有對照特征圖譜并建立王不留行UPLC特征圖譜，如圖4所示。

注：1.刺桐堿；2(S).王不留行黃酮苷

注：1.刺桐堿；2(S).王不留行黃酮苷

2.5.2 特征圖譜方法學考察 (1)精密度試驗。同“2.4.3”項下測定，記錄色譜圖，以2號峰王不留行黃酮苷的色譜峰為參照峰，對各圖譜的特征峰的相對保留時間和相對峰面積進行計算，結果各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯變化，其RSD值分別為0.00%～0.10%和0.00%～0.08%，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜研究技術的要求。

(2)穩(wěn)定性試驗。同“2.4.3”項下(4)測定，記錄色譜圖，以2號峰王不留行黃酮苷的色譜峰為參照峰，對各圖譜的特征峰的相對保留時間和相對峰面積進行計算，結果各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯變化，其RSD值分別為0.00%～0.33%和0.00%～0.52%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好，符合特征圖譜研究技術的要求。

(3)重復性試驗。同“2.4.3”項下(5)測定，記錄色譜圖，以2號峰王不留行黃酮苷的色譜峰為參照峰，對各圖譜的特征峰的相對保留時間和相對峰面積進行計算，結果各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯變化，其RSD值分別為0.00%～0.24%和0.00%～0.14%，表明該方法重復性良好，符合特征圖譜研究技術的要求。

2.5.3 特征圖譜檢測與分析 將3批實驗用生品、爆花和僵子飲片分別按照“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”條件測定并記錄色譜圖，統(tǒng)計各共有峰特征峰保留時間和峰面積，見表7-表8，分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》(2012A)進行特征圖譜比較分析。如圖5所示，以峰2王不留行黃酮苷作為參照峰，計算各共有峰特征峰相對保留時間和相對峰面積，見表9-表10；并計算各樣品與20批王不留行藥材生成的共有對照特征圖譜間相似度，見表11；同時，將王不留行生品、爆花和僵子飲片分別生成共有對照指紋圖譜進行直觀比較，如圖6所示。

表7 共有特征峰保留時間 (min)

表8 共有特征峰峰面積

表9 共有特征峰相對保留時間 (min)

表10 共有特征峰相對峰面積

表11 相似度計算結果

實驗結果顯示，王不留行生品、炒制后爆花和僵子飲片各共有峰特征峰保留時間和相對保留時間較穩(wěn)定，而各共有峰特征峰的峰面積和相對峰面積發(fā)生了明顯變化。炒制后，峰1、2、4峰面積均明顯降低，且爆花飲片下降比僵子飲片明顯，而炒制后峰3峰面積明顯變大，但爆花和僵子飲片間差異性不大，均增大約2倍，峰5則基本不變，較為穩(wěn)定。

各樣品與20批王不留行藥材生成的共有對照特征圖譜間相似度均在0.90以上，相似度較高，表明炒制前后主要化學成分和色譜峰的數量基本一致，如圖6直觀可見，但爆花飲片與生成的共有對照特征圖譜間的相似度均低于僵子，表明炮制后爆花飲片各色譜峰變化程度大于僵子。

注：S1-S3為生品；B1-B3為爆花；J1-J3為僵子

注：A為生品；B為爆花；C為僵子

3 討論

實驗結果表明，炒制后飲片均能明顯增大生品的水溶性浸出物，但爆花飲片對生品的水溶出率提高能力約為僵子飲片的2倍；炒制后主要指標成分含量均出現明顯下降，炒制過程中含量不斷損失，爆花飲片主要指標成分損失量明顯大于僵子飲片，可能是僵化現象減少了指標成分的破壞損失?！吨袊幍洹?015年版王不留行藥材含量測定項規(guī)定王不留行黃酮苷不得少于0.40%，炒王不留行飲片含量測定項規(guī)定王不留行黃酮苷不得少于0.15%，也說明該成分炮制后是會明顯降低，但未對炮制品含量上限作出進一步規(guī)定。受限于當前生產炒藥技術和設備水平，機炒王不留行的爆花率偏低一直是中藥炮制的重難點之一，僵化現象較為常見，炒王不留行飲片中混有較多僵子，其王不留行黃酮苷的含量會明顯高于完全爆開白花飲片的含量，出現炮制品含量符合藥典要求，但實際飲片性狀不符合藥典要求的情況。特征圖譜結果顯示，炒制后爆花和僵子飲片峰1、2、4峰面積均明顯降低，且爆花飲片降低幅度均大于僵子飲片，爆花飲片與生品相似度較小，說明兩者間差異性較大?？傮w來看，炮制合格爆花飲片從水溶性浸出物、主要指標成分含量、特征圖譜總體情況等與生品間的差異性較大，這也是王不留行生品炮制可以明顯提高其活血通經、下乳、通淋的作用其意義所在，而僵子與生品差異性較小，主要指標成分含量雖然合格，但會影響炒王不留行合格飲片的水溶出率，降低炒王不留行水提過程有效成分的煎出，同時也影響特征圖譜中部分峰的變化，僵子飲片可能難以發(fā)揮炒制合格的爆花飲片長于王不留行生品的功效，有待進一步研究。

炮制作為中藥的精華和特色，對保證中藥臨床療效具有十分重要的作用。中醫(yī)醫(yī)師在臨證處方時，常根據不同病情選用不同炮制品，有目的地運用以提高臨床療效。因此，炒王不留行不同爆花程度的飲片選擇和質量控制對中醫(yī)臨床的安全性和有效性至關重要。本實驗建立了王不留行炮制前后UPLC特征圖譜，分離效果好，重復性強，保留時間相對穩(wěn)定，各共有特征峰含量變化明顯，且可同時測定刺桐堿含量，能簡單快速全面地控制王不留行炮制前后特征信息，并結合《中國藥典》2015版“王不留行”項下王不留行黃酮苷含量測定方法，對王不留行炮制前后主要指標成分刺桐堿和王不留行黃酮苷進行雙指標含量控制，更加全面系統(tǒng)地評價王不留行炮制前后及不同炒制程度爆花與僵子飲片的差異性，更好地保證飲片質量和臨床療效。