許宗仁1 包旭宏2

1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730030；2. 甘肅奇正藏藥有限公司，甘肅 蘭州 730010

如意珍寶丸收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》1995年版藏藥第一冊第317頁，又名“桑培奴布日布”，原劑型為丸劑[1]。為解決傳統(tǒng)藏藥丸劑丸重差異大、崩解時限不易控制，衛(wèi)生學指標不合格等問題。甘肅奇正藏藥有限公司按照國家藥品監(jiān)督管理局有關(guān)規(guī)定的要求[2]，將丸劑改為片劑并獲得生產(chǎn)批件(批件號：Z20100061)。如意珍寶丸成分復(fù)雜，包含揮發(fā)性成分、生物堿、無機鹽、黃酮類、脂肪酸、氨基酸等。原標準只有紅花和降香藥材的顯微鑒別，在中醫(yī)藥現(xiàn)代化迅猛發(fā)展的今天，原標準已然不能很好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量[1]。本研究通過查閱文獻并結(jié)合自身實驗研究，增加了乳香、降香、木香和丁香4個藥材的TLC薄層鑒別方法和紅花、蓽茇2個藥材的HPLC含量測定方法，對該藥的質(zhì)量標準做了提高和完善。

1 實驗材料

1.1 儀器 安捷倫1160高效液相色譜儀(美國Agilent公司)：包括LC-295紫外可見檢測器，200LC泵，ANAS-TAR色譜工作站；SK8200HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；HY-4調(diào)速多用振蕩器(金壇市華峰儀器有限公司制造)；XS205DU分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司生產(chǎn))。

1.2 試藥 甲醇、乙腈均為色譜純試劑(購自賽默飛世爾科技中國有限公司)，其余為分析純。硅膠G板(青島海洋化工有限公司)；乳香對照藥材(批號：12907-201702)；降香對照藥材(批號：120952-201804)；木香對照藥材(批號：120921-201709)；丁香酚對照品(批號：110725-201716)；羥基紅花黃色素A(批號為：111637-201810)；胡椒堿對照品(批號為：110775-201706)，以上對照品和對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。 如意珍寶片由甘肅奇正藏藥有限責任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 處方中乳香的薄層鑒別 取本品6片，研細，置于錐形瓶中，加入10.0 mL的95%乙醇，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干后放冷，殘渣加甲醇1.0 mL使溶解，作為供試品溶液。另取乳香對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再按處方比例及制備工藝，配制不含乳香的陰性對照樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015版通則0502，下同)試驗，分別用毛細管取上述兩種溶液各5 μL，依次點于同一硅膠G薄層板(10 cm×10 cm)上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(15:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的褐色斑點，且陰性無干擾。照片見圖1。

供試品：1、2、3樣品 4、5乳香對照藥材 6、陰性對照圖1 如意珍寶片(乳香)藥材薄層鑒別

2.1.2 降香的薄層鑒別 取本品6片，研細，置于錐形瓶中，加入20.0 mL的95%乙醇，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干后放冷，殘渣加甲醇2.0 mL使溶解，作為供試品溶液。另取降香對照藥材1.0 g，加乙醇10.0 mL，同法制成對照藥材溶液。再按處方比例及制備工藝配制成不含降香的陰性對照樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，分別用毛細管取上述溶液各5 μL，依次點于同一硅膠G薄層板(10 cm×10 cm)上，以甲苯-乙酸乙酯(2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，至紫外燈(365 nm)下檢視，在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的淺藍色熒光斑點，陰性無干擾。再噴以1%香草醛試液與無水乙醇(1∶9)的混合液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的棕色斑點，且陰性無干擾，照片見圖2、圖3。

供試品：1、2降香對照藥材，3、4樣品， 5、6陰性對照圖2 如意珍寶片(降香)藥材薄層鑒別(365nm熒光檢視)

供試品：1、2降香對照藥材，3、4樣品，5、6陰性對照圖3 如意珍寶片(降香)藥材薄層鑒別顯色后檢視

2.1.3 木香的薄層鑒別 取本品6片，研細，置于具塞錐形瓶中，加入15.0 mL乙醚，密塞，振搖提取1 h，濾過，濾液濃縮至1.0 mL，作為供試品溶液。另取去木香對照藥材0.5 g，同法制成每0.5 mg/mL的對照藥材溶液。再按處方比例及制備工藝配制成不含木香的陰性對照樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，分別用毛細管取上述溶液各5 μL，依次點于同一硅膠G薄層板(10 cm×10 cm)上，以石油醚(60～90 ℃)-苯-醋酸乙酯(5∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的藍綠色斑點，且陰性無干擾，照片見圖4。

供試品：1、2木香對照藥材，3、4樣品，5、6陰性對照圖4 如意珍寶片(木香)藥材薄層鑒別

2.1.4 處方中丁香的薄層色譜鑒別 取本品6片，研細，置于錐形瓶中，加入20.0 mL正己烷，振揺提取10 min，濾過，濾液蒸干后放冷，殘渣加正己烷1.0 mL使溶解，作為供試品溶液。另取丁香酚對照品(ρ=1.067)0.5 mL，加正己烷稀釋至25.0 mL，搖勻，制成濃度為21.3 mg/mL的對照品溶液。再按處方比例及制備工藝，配制不含丁香的陰性對照樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，分別用毛細管取對照品溶液0.5 μL、取供試品液和陰性溶液各2 μL，依次點于同一硅膠G薄層板(10cm×20cm)上，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的棕黃色斑點，且陰性無干擾。照片見圖5。

供試品：1、2丁香酚對照品，3、4樣品，5、6陰性對照圖5 如意珍寶片(丁香)藥材薄層鑒別(日光燈下檢視)

2.2 羥基紅花黃色素A的HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：Kromasil 100-5- C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn))；流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸(26∶2∶72)；流速：0.80 mL/min；檢測波長：403 nm；柱溫：室溫。

2.2.2 色譜系統(tǒng)適用性試驗 在“2.2.1”中的色譜條件下，羥基紅花黃色素A與其余雜質(zhì)峰分離效果較好，理論板數(shù)以羥基紅花黃色素A峰計，應(yīng)不低于2500。

2.2.3 對照品溶液與供試品溶液及陰性溶液的配制 取羥基紅花黃色素A對照品5.0 mg于25 mL容量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，制成每0.2 mg/mL的對照品溶液。另取本品20片，研細后精密稱取5g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25%的甲醇50.0 mL，稱定重量，超聲提取(功率160 W，頻率59 kHz)40 min，放冷，用25%的甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5.0 mL于10.0 mL容量瓶中，加25%的甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。再按處方比例及制備工藝配制成不含紅花的陰性對照樣品，取5.0 g，同法制成陰性對照溶液。

2.2.4 專屬性試驗 精密吸上述取供試品溶液、陰性液和對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀中，在與羥基紅花黃色素A對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品液具有相同保留時間的色譜峰出現(xiàn)；而陰性對照溶液在該處無色譜峰，說明專屬性良好。說明專屬性良好。見圖6。

圖6 羥基紅花黃色素對照品(A)、如意珍寶片樣品(B)、紅花陰性樣品(C)

2.2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取上述對照品溶液(0.2 mg/mL)各0.5、1、1.5、2.5、4.5、5.0 mL、分別置于10.0 mL的容量瓶中，加入25%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。取上述對照品溶液各20 μL，按照“2.2.1”項下的色譜條件，注入液相色譜儀，測定峰面積，結(jié)果見表1。以峰面積值為縱坐標，進樣量為橫坐標作圖，進行線性回歸分析，得出羥基紅花黃色素A的標準曲線方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見圖7。結(jié)果表明其在0.01～0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)峰面積與對照品的濃度線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=72397x+28.857(r=0.9999)。

表1 羥基紅花黃色素A對照品濃度與峰面積數(shù)據(jù)

2.2.6 精密度試驗 取如意珍寶片(批號: 20180401)，按照“2.2.3”項下的方法，制成供試品溶液，依“2.2.1”項下的色譜條件，精密吸取供試品溶液，重復(fù)進樣5次，測定羥基紅花黃色素A峰面積值，其平均值為2133.42，RSD值為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批號的供試品(批號20180401)，按照“2.2.3”項下處理方法，制成供試品溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件，精密吸取該供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8 h進樣，測定峰面積，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，平均值為2317.8，RSD值為0.44%。

2.2.8 重現(xiàn)性試驗 取本品(批號:20180401)5份，按照“2.2.3”項下處理方法，制備5份供試品溶液，分別測定，記錄峰面積。計算羥基紅花黃色素A的含量及RSD值，結(jié)果重現(xiàn)性較好，平均值0.644 mg/g，RSD值為1.77%。

2.2.9 回收率試驗 取已知含量(0.64 mg/g)的如意珍寶片(批號: 20180401)6份，研細,每份約1.5g，精密稱定，分別加入2.0 mL濃度為0.2 mg/mL的羥基紅花黃色素A對照品溶液。再按照“2.2.3”項下處理方法，制成供試品溶液，根據(jù)“2.2.1”項下的色譜條件依法測定，供試品中羥基紅花黃色素A的加樣回收率的RSD值為1.86%，表明該方法回收率良好。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗數(shù)據(jù)

2.2.10 樣品中羥基紅花黃色素A的含量測定 取7批樣品(批號：180401、180402、180506、180507、180608、180709、180801)，每批2份，按照“2.2.3”項下處理方法，制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液20μL，按照“2.2.1”項下的色譜條件，依法測定，記錄峰面積、計算羥基紅花黃色素A的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中羥基紅花黃色素A的含量測定數(shù)據(jù)

2.3 胡椒堿的含量測定

2.3.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：Kromasil 100-5- C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn))；流動相：甲醇-水(65:35)；流速：1.0 mL/min；檢測器: DAD檢測器；檢測波長：350 nm；柱溫：室溫。

2.3.2 色譜系統(tǒng)適用性試驗 在該色譜條件下，胡椒堿與其余雜質(zhì)峰分離效果較好，理論板數(shù)以胡椒堿峰計應(yīng)不低于13000。

2.3.3 對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液的配制 稱取胡椒堿對照品0.40 mg，精密稱定，置于10.0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取本品15片，研細后精密稱取3.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30.0 mL甲醇，稱定重量，超聲提取(功率160 W，頻率59 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾取1.0 mL，作為供試品液。再按處方比例及制備工藝配制成不含蓽茇的陰性對照樣品，取3.0 g，同法制成陰性對照溶液，備用。

2.3.4 專屬性試驗 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL注入液相色譜儀，在與胡椒堿對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品液具有相同保留時間的色譜峰出現(xiàn)；而陰性對照溶液在該保留時間無色譜峰，說明專屬性良好。見圖8。

圖8 胡椒堿對照品(A)、如意珍寶片樣品(B)、蓽茇陰性對照(C)

2.3.5 線性關(guān)系考察 取胡椒堿對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成 0.005、0.010、0.020、0.041、0.082、0.163 mg/mL對照品溶液，取上述對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，結(jié)果見表4。以峰面積值為縱坐標，進樣量為橫坐標作圖，進行線性回歸分析，得出胡椒堿的標準曲線方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見圖9。結(jié)果表明，胡椒堿在0.005～0.163 mg/mL內(nèi)峰面積與對照品的濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=56094x+33.384(r=1)。

表4 胡椒堿對照品濃度與峰面積數(shù)據(jù)

2.3.6 精密度試驗 精密吸取同一對胡椒堿照品溶液(0.041 mg/mL)10μL，連續(xù)進樣6次，測定其峰面積，結(jié)果表明，精密度良好，平均值2355.07，RSD值為0.22%。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取本品(批號: 20190801)3.0g，按照“2.3.3”項下處理方法，制成供試品溶液，再按照“2.3.1”項下的色譜條件，精密吸取該供試品溶液10μL，于0、2、4、6、12、24、48 h分別進樣，測定峰其面積。結(jié)果顯示，樣品在在48 h內(nèi)測定，穩(wěn)定性良好，平均值為1958.1，RSD值為2.19%。

2.3.8 重現(xiàn)性試驗 取本品(批號: 20190801)6份，按照“2.3.3”項下處理方法，制成供試品溶液，再按照“2.3.1”項下的色譜條件，分別進樣，計算胡椒堿的含量及RSD值，結(jié)果表明，重現(xiàn)性較好，平均值0.35 mg/mL，RSD值為1.19%。

2.3.9 回收率試驗 取已知含量(0.345 mg/g)的如意珍寶片(批號: 20190801)6份，研細,每份約0.5g，精密稱定，分別加入胡椒堿對照品溶液(0.1 mg/mL)3.0 mL，按照“2.3.3”項下處理方法，制成供試品溶液，再按照“2.3.1”項下的色譜條件，依法測定，供試品中羥基紅花黃色素A的加樣回收率的RSD值為 1.67%，表明本法回收率良好。結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗數(shù)據(jù)

2.3.10 樣品中胡椒堿的含量測定 取10批樣品(批號：170301、181109、190401、190801、190903、191001、191002、191003、191101、191102)，每批2份，按照“2.3.3”項下處理方法，制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液20μL，按照“2.3.1”項下的色譜條件，依法測定，記錄峰面積、計算樣品中胡椒堿的含量，結(jié)果見表6。

表6 樣品中胡椒堿的含量測定數(shù)據(jù)

續(xù)表6表6 樣品中胡椒堿的含量測定數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 薄層色譜研究 通過文獻[2-19]查閱，本研究采用TLC法對如意珍寶片中的乳香、降香、丁香、木香的進行了鑒別，結(jié)果色譜斑點清晰、分離度良好，且陰性無干擾；可有效控制如意珍寶片的質(zhì)量。其余藥材(如檀香、藏木香、香旱芹等)因為處方藥材數(shù)量較多，陰性干擾尚無法消除，待進一步研究。

3.2 含測藥材的篩選 研究前期，參照《中國藥典》2015年版一部，采用HPLC法對高良姜、木香、藏木香等做了含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以高良姜中的高良姜素、木香中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯、藏木香中的土木香內(nèi)酯和異木香內(nèi)酯作為檢測指標時，陰性樣品在與對照品相同的保留時間上出現(xiàn)小峰干擾，經(jīng)反復(fù)試驗，調(diào)整溶劑、流動相比例和檢測波長等方法，均不能消除陰性干擾，故不可作為含量測定指標。而紅花藥材處方含量相對較大，有效成分明確，故參照相關(guān)資料[20-29]，采用HPLC對該指標做了專屬性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品和對照品的分離度較好，且陰性在選定的色譜條件下無干擾。由此建立了處方中羥基紅花黃色素A的含量測定方法。處方中蓽茇具有較好的止痛作用[2-3]，故參照《中國藥典》2015年版一部“蓽茇”項下采用外標法測定其有效成分胡椒堿的含量，但由于如意珍寶片中化學成分較多，胡椒堿出峰時間較早，基線不平。經(jīng)反復(fù)試驗并改進方案(流動相和檢測波長)，最終建立了處方中蓽茇的主要有效成分胡椒堿的含量測定方法。

3.3 羥基紅花黃色素A提取溶媒、提取方法的選擇

3.3.1 提取溶媒的選擇 資料顯示羥基紅花黃色素A為親水性成分，在水和低濃度的醇中溶解度較大；本研究先后采用純水，25%甲醇、25%乙醇、38%甲醇、50%乙醇作為溶媒進行提取，發(fā)現(xiàn)用純水、38%甲醇、25%乙醇以及50%乙醇做提取時，樣品中紅花黃色素A的溶解度均較大，但不利于樣品濾過，當采用25%甲醇時紅花黃色素A的溶解度大且過濾相對容易。故確定以25%甲醇為溶媒。

3.3.2 不同提取方法對處方中羥基紅花黃色素A含量的影響 本研究發(fā)現(xiàn)采用25%甲醇回流提取和超聲提取(30 min)方式，對樣品中羥基紅花黃色素A的含量基本一致，故選擇相對便捷的超聲提取方法對樣品進行處理。

3.4 胡椒堿提取溶媒、提取方法的選擇

3.4.1 提取溶媒的選擇 資料[10-15]顯示胡椒堿為醇溶性成分，難溶于水易溶于醇。本研究先后采用甲醇、無水乙醇，95%乙醇作為溶媒進行超聲(30mim)提取，試驗發(fā)現(xiàn)甲醇、無水乙醇，95%乙醇均能提取出胡椒堿，但甲醇對樣品中胡椒堿的溶解度最大，故確定以甲醇為溶媒。

3.4.2 不同提取方法的選擇 以甲醇為溶劑，采用回流、超聲、振揺三種提取方式將樣品提取30 min。經(jīng)HPLC檢測后發(fā)現(xiàn)：振揺提取的效率最低；甲醇回流提取略大于超聲提取樣品中胡椒堿的含量。但為了提高工作效率，節(jié)省檢驗時間，本研究選用超聲處理的方法對樣品進行提取。

3.5 不同色譜柱的比較 采用3種不同廠家生產(chǎn)同型號的色譜柱(依利特、安捷倫、菲羅門)，按照各自色譜條件分別對胡椒堿和羥基紅花黃色素A進行檢測，樣品分離效果及含量無明顯差異。

4 結(jié)論

如意珍寶片中乳香、降香、木香、丁香的TLC斑點清晰，且陰性無干擾，可作為薄層鑒別項下的質(zhì)量標準。根據(jù)HPLC含量測定結(jié)果，如意珍寶片中羥基紅花黃色素A的含量在0.37 mg/g～0.755 mg/g的范圍內(nèi)，胡椒堿的含量在0.26 mg～0.37 mg的范圍內(nèi)。故暫定本品中每1 g含羥基紅花黃色素A應(yīng)不得少于0.3 mg，含胡椒堿應(yīng)不得少于0.20 mg。