趙 昇，王曉榮，張進(jìn)明

〈紅外應(yīng)用〉

發(fā)酵液中甘油和丁醇含量的近紅外快速檢測(cè)方法

趙 昇，王曉榮，張進(jìn)明

（南京工業(yè)大學(xué) 電氣工程與控制科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211800）

為了提高生物發(fā)酵過(guò)程的控制與優(yōu)化水平，試對(duì)發(fā)酵底物甘油和目標(biāo)產(chǎn)物丁醇的含量進(jìn)行快速無(wú)損檢測(cè)進(jìn)行研究。首先對(duì)80份甘油與丁醇的單體系樣本進(jìn)行近紅外掃描并進(jìn)行光譜分析。為提高模型的預(yù)測(cè)能力，分別采用了偏最小二乘法、間隔偏最小二乘法、向前間隔偏最小二乘法、向后間隔偏最小二乘法和窗口移動(dòng)最小二乘法5種定量校正方法建立甘油和丁醇含量的近紅外檢測(cè)模型并對(duì)模型進(jìn)行分析與比較。結(jié)果表明，向后間隔偏最小二乘法建立的模型效果較好，甘油和丁醇的單組份溶液的檢測(cè)模型相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.99932（甘油）和0.98843（丁醇）。為測(cè)量真實(shí)的甘油發(fā)酵液中甘油和丁醇含量，搭建并建立了甘油和丁醇濃度監(jiān)測(cè)平臺(tái)，驗(yàn)證得相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.99074（甘油）和0.99261（丁醇）。結(jié)果表明建立的近紅外快速檢測(cè)模型在檢測(cè)的準(zhǔn)確性和快速性上均有優(yōu)異的性能，為發(fā)酵行業(yè)快速檢測(cè)提供了新的檢測(cè)手段。

近紅外光譜技術(shù)；向后間隔偏最小二乘；甘油發(fā)酵；丁醇

0 引言

生物發(fā)酵行業(yè)是我國(guó)的支柱行業(yè)之一，但由于生產(chǎn)技術(shù)比較落后，發(fā)酵產(chǎn)物中附加產(chǎn)物較多，而且新一代的發(fā)酵制品如生物酶、干擾素等前沿產(chǎn)物主要被歐美國(guó)家控制，我國(guó)發(fā)酵工業(yè)的技術(shù)水平與國(guó)外仍有較大差距。由于發(fā)酵過(guò)程比較復(fù)雜，傳統(tǒng)的生物傳感器在自動(dòng)控制系統(tǒng)中不能滿足生產(chǎn)需求，生產(chǎn)過(guò)程最直接的控制參數(shù)生物（生化）參數(shù)（包括底物、重要中間代謝物和目標(biāo)產(chǎn)物等）快速檢測(cè)或在線檢測(cè)技術(shù)的缺乏，是整個(gè)行業(yè)面臨的瓶頸技術(shù)?？梢?jiàn)，快速監(jiān)測(cè)發(fā)酵液底物與產(chǎn)物的變化對(duì)于實(shí)現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵從“粗放化、間歇式”向“精密化、連續(xù)化”的生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)型具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[1]。而丁醇作為一種有機(jī)化工原料，其熱值與辛烷值和乙醇十分相似，且具有能量含量高、揮發(fā)性低、減少溫室氣體排放等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是比乙醇更為理想的燃料，丁醇還可以用于塑料制品的制造及食用香味的提取等。但工業(yè)生產(chǎn)丁醇主要以石油為原料，而隨著能源的枯竭，發(fā)酵法的發(fā)展前景越來(lái)越受重視，大有取代化學(xué)法的趨勢(shì)。因此，十分有必要研究并提供一種快速檢測(cè)發(fā)酵液中甘油與丁醇含量的方法[2]。

近紅外光譜技術(shù)在檢測(cè)含氫、碳、氮等有機(jī)物的成分上其優(yōu)勢(shì)非常明顯，因其速度快、無(wú)損性、易操作等檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用[3]。國(guó)內(nèi)外很多專家學(xué)者應(yīng)用近紅外技術(shù)在發(fā)酵檢測(cè)領(lǐng)域進(jìn)行學(xué)術(shù)研究。Cavinato等采用短波近紅外光譜技術(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中乙醇的含量進(jìn)行了測(cè)定[4]。Macalony等人在工業(yè)上高密度大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中采用了近紅外光譜測(cè)定了甘油、銨鹽和乙酸的濃度[5]。Arnold等人采用近紅外光譜技術(shù)測(cè)定CHO細(xì)胞分批發(fā)酵過(guò)程中氨酰胺、氨基酸、葡萄糖與乳酸的含量[6]。但甘油和丁醇這些中工業(yè)發(fā)酵過(guò)程起關(guān)鍵作用而光譜相似的狀態(tài)變量卻是鮮有報(bào)道。而且基于MEMS的近紅外光譜儀體積小、分辨率高、價(jià)格低，解決了目前由于光譜儀體積大，價(jià)格高等原因造成其在發(fā)酵工業(yè)中不能普及的問(wèn)題[7]。因此，本文開(kāi)展了基于MEMS近紅外分析技術(shù)在甘油轉(zhuǎn)丁醇的發(fā)酵過(guò)程對(duì)參數(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)的應(yīng)用與研究，為甘油發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)甘油與丁醇含量提供了一種快速、低價(jià)格的檢測(cè)手段。

1 檢測(cè)模型的比較

1.1 試劑與儀器

DLP NIRscan Nano EVM近紅外光譜儀，電子天平（精度為0.0001g）、恒溫箱、去離子蒸餾水、量筒、培養(yǎng)皿、滴管、甘油、丁醇等。

1.2 儀器參數(shù)設(shè)定與光譜采集

配置不同濃度的甘油與丁醇溶液，采用去離子蒸餾水精確配置容量為4mL，濃度為1～80g/L的甘油與丁醇的樣本溶液80份，濃度間隔為1%。采用美國(guó)TI公司生產(chǎn)的NIRscan Nano近紅外光譜儀，掃描32次，分辨率為7cm－1，波數(shù)間隔為2cm－1。以空氣為參比，室內(nèi)溫度保持在25℃左右，濕度基本保持不變，每個(gè)樣本平行采集3次，取其平均光譜作為該樣本的原始光譜。

1.3 樣本集的劃分

若選擇的校正樣本比較具有代表性，則在建模的時(shí)候可以減少很多的工作量，而且可以提高模型的精確度[8-9]。濃度梯度法可以有效地涵蓋組分含量，避免了樣本集劃分的不均勻，而且保證了后續(xù)處理和建模方法的適用范圍。根據(jù)濃度梯度法本文將正常的74個(gè)甘油與丁醇樣本按照濃度梯度法2:1的比例進(jìn)行排序。表1為劃分校正集與預(yù)測(cè)集的有機(jī)質(zhì)含量統(tǒng)計(jì)表，校正集中甘油含量的范圍為：1～80g/L，預(yù)測(cè)集中甘油含量為：4～79g/L；丁醇校正集含量范圍為：1～80g/L，預(yù)測(cè)集含量為：3～79g/L。

1.4 光譜預(yù)處理

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器的噪音總會(huì)避免不了，因此在模型建立之前要先對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理[10]。本文采用S-G、多元散射校正、導(dǎo)數(shù)校正和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)校正對(duì)甘油和丁醇樣本的光譜進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果如表2所示。

從表2中我們可以看出，不同的預(yù)處理方法，對(duì)建立的模型精度有不同的影響。模型評(píng)價(jià)指標(biāo)有很多，本文選用了相關(guān)系數(shù)（c）和交互驗(yàn)證均方根誤差（Root Mean Square Error For Validation，RMSECV）作為評(píng)價(jià)模型的可信度。一般來(lái)說(shuō)，相關(guān)系數(shù)越大，交互驗(yàn)證均方根誤差越小，說(shuō)明近紅外模型的測(cè)定值與實(shí)際值越吻合，模型的準(zhǔn)確度越高，也即所建立的模型效果越好。明顯可以看出采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（Standard Normal Variables，SNV）的方法在c和（Root Mean Square Error For Prediction，RMSECP）兩個(gè)指標(biāo)上性能優(yōu)異，是最優(yōu)的預(yù)處理方法。

1.5 模型的建立與最優(yōu)模型的建立

本實(shí)驗(yàn)分別在甘油和丁醇的原始光譜圖采用SNV預(yù)處理之后，建立了偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）、間隔偏最小二乘（Interval Partial Least Squares，IPLS）、向前間隔偏最小二乘法（Forward Interval Partial Least Squares，F(xiàn)IPLS）、向后間隔偏最小二乘法（backward Interval Partial Least Squares，BIPLS）、移動(dòng)窗口偏最小二乘法（Moving Window Partial Least Squares，MWPLS）5種校正集樣本模型[11-13]。建模結(jié)果采用RMSECV作為模型的最終評(píng)價(jià)指標(biāo)，表3為PLS模型預(yù)測(cè)結(jié)果。

表1 校正集與預(yù)測(cè)集生物量的測(cè)量結(jié)果

表2 不同預(yù)處理結(jié)果甘油和丁醇的預(yù)測(cè)模型結(jié)果

表3 PLS模型的預(yù)測(cè)結(jié)果

從甘油與丁醇的預(yù)測(cè)結(jié)果來(lái)看，5種PLS回歸模型中，iPLS、FiPLS、BiPLS、MWPLS都是對(duì)偏最小二乘法的改進(jìn)，模型的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確度有一定的提高。通過(guò)數(shù)據(jù)比較，可以得出BiPLS模型可以減少無(wú)效波段對(duì)模型的影響，同時(shí)減少了計(jì)算機(jī)的計(jì)算量，建立的模型效果最好。但真實(shí)的發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵液的組成成分與標(biāo)準(zhǔn)溶液有很大的區(qū)別，且丁醇的含量是逐漸上升的，模型的效果還需經(jīng)過(guò)真實(shí)發(fā)酵液檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 模型的驗(yàn)證

2.1 發(fā)酵液的制備與測(cè)定

儀器：生物傳感儀、DLP NIRscan近紅外光譜儀（美國(guó)德州儀器）、電子天平（精度0.0001g）、5L發(fā)酵罐、TQ Analyst計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)。

試劑：甘油、酵母粉、二硫蘇糖醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽、九水硫化鈉、氯化鈉、六水氯化鎂、氯化銨等。菌體培養(yǎng)基參數(shù)如表4所示。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要保持發(fā)酵罐中的pH值為7.0～7.2；溶氧控制維持：0～10%；溫度控制：初始溫度為34℃。

表4 培養(yǎng)基參數(shù)列表

含量測(cè)定：實(shí)時(shí)取出的發(fā)酵液中甘油和丁醇的含量采用生物傳感儀進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的數(shù)據(jù)用來(lái)建立甘油發(fā)酵液模型。然后再?gòu)陌l(fā)酵罐中取出10組未知濃度樣品檢測(cè)模型的準(zhǔn)確性如表5所示（1已知樣本，2未知樣本）。

表5 發(fā)酵液中甘油與丁醇含量

2.2 近紅外光譜采集

采用近紅外漫反射法對(duì)上述發(fā)酵液進(jìn)行采集，以空氣為參比。儀器參數(shù)設(shè)置為：分辨率為10nm，掃描次數(shù)30次。采集的光譜圖如圖1所示。

圖1 甘油發(fā)酵液的近紅外光譜圖

2.3 樣本集的劃分

按照濃度梯度法對(duì)樣本集按照校正集︰預(yù)測(cè)集＝2︰1的比例進(jìn)行劃分。樣本劃分如表6所示。

2.4 模型的建立

本節(jié)直接將樣本光譜經(jīng)過(guò)SNV預(yù)處理之后，再結(jié)合BiPLS建立模型，其結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2和圖3可以看出，甘油發(fā)酵液的甘油校正模型相關(guān)系數(shù)為0.99074，交互驗(yàn)證均方根誤差為1.11，而甘油發(fā)酵液的丁醇模型相關(guān)系數(shù)為0.99261，交互驗(yàn)證均方根誤差為1.09，相關(guān)系數(shù)均接近1，RMSEC數(shù)值均較小，表明模型的預(yù)測(cè)能力較好，精確度較高。

2.5 傳統(tǒng)的生物測(cè)量法與近紅外檢測(cè)法的比較

使用生物傳感儀對(duì)未知樣本進(jìn)行濃度測(cè)定，然后采用近紅外光譜儀對(duì)未知樣本進(jìn)行光譜采集，使用建立的甘油發(fā)酵模型預(yù)測(cè)甘油與丁醇的濃度如表7，結(jié)果比較如圖4所示。

生物發(fā)酵中，基本上采用生物傳感儀測(cè)量發(fā)酵液的組分含量，目前市場(chǎng)上高精度的生物傳感儀的測(cè)量誤差基本也保持在1%～2%以內(nèi)。從表7可以看出，當(dāng)以生物傳感儀測(cè)量值為標(biāo)準(zhǔn)值時(shí)，采用近紅外光譜技術(shù)測(cè)量值甘油的平均測(cè)量誤差為3.29%，丁醇的平均測(cè)量誤差為4.58%。發(fā)酵過(guò)程需要控制測(cè)定范圍，測(cè)量誤差為5%，顯然精度是滿足要求的。從圖4可以看出模型對(duì)未知樣本的預(yù)測(cè)與傳統(tǒng)方法測(cè)定的真實(shí)值時(shí)極為接近的，模型的預(yù)測(cè)能力較好。近紅外光譜方法相比傳統(tǒng)的生物方法有著明顯的優(yōu)勢(shì)，尤其在測(cè)量速度上，通常可以在幾秒內(nèi)就可以完成，可應(yīng)用于過(guò)程分析，而且不需對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，降低了人為因素誤差。因此，近紅外光譜分析技術(shù)測(cè)定甘油發(fā)酵過(guò)程中甘油與丁醇的含量是一種切實(shí)可行的快速檢測(cè)方法。

表6 樣本集的劃分

圖2 甘油發(fā)酵液中甘油校正模型預(yù)測(cè)圖

圖3 甘油發(fā)酵液中丁醇校正模型預(yù)測(cè)圖

表7 傳統(tǒng)生物檢測(cè)與近紅外檢測(cè)結(jié)果

圖4 傳統(tǒng)生物測(cè)量方法與近紅外檢測(cè)結(jié)果示意圖

3 總結(jié)

本文研究了近紅外光譜技術(shù)在發(fā)酵制備丁醇過(guò)程中底物甘油和丁醇含量的快速檢測(cè)方法。首先根據(jù)甘油與丁醇的近紅外微觀特性，確定了甘油和丁醇的吸收峰分別為（1149～1265nm和1666～1801nm），然后采用PLS、iPLS、FiPLS、BiPLS、MWPLS對(duì)甘油與丁醇的單體系溶液，建立了校正模型。通過(guò)對(duì)比分析，BiPLS可以減少無(wú)效波段對(duì)模型的影響，同時(shí)減少了計(jì)算機(jī)的運(yùn)算量，建立的模型效果最好，為真實(shí)甘油發(fā)酵的模型建立提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。針對(duì)甘油發(fā)酵液的特性，采用了BiPLS建立了甘油發(fā)酵液的校正模型，并采用傳統(tǒng)生物檢測(cè)方法和甘油發(fā)酵模型對(duì)未知樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，在甘油轉(zhuǎn)丁醇的發(fā)酵過(guò)程，NIRS可以作為一種快速、低價(jià)格的檢測(cè)手段，為發(fā)酵行業(yè)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制提供了理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

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Rapid Detection of Glycerol and Butanol in Fermentation Broth Using Near-Infrared Spectroscopy

ZHAO Sheng，WANG Xiaorong，ZHANG Jinming

(College of Electrical Engineering and Control Science, Nanjing Tech University, Nanjing 211800, China)

In this paper, to improve the control and optimization of the bio-fermentation process, rapid and non-destructive detection of glycerol and butanol was studied. To this end, 80 samples of glycerol and butanol were scanned and analyzed by means of near-infrared spectroscopy. Furthermore, in order to improve the predictive ability of the model, five quantitative calibration methods, namely, the partial least squares method, interval partial least squares method, forward interval partial least squares method, backward interval partial least squares method, and minimum forward interval method were used to establish the near-infrared detection model for glycerol and butanol content. The models were then analyzed and compared. The results showed that the model established by means of the backward interval partial least squares method was effective, and the correlation coefficients of the single component solution of glycerol and butanol were 0.99932 (glycerol) and 0.98843 (butanol), respectively. To measure the content of glycerol and butanol in the glycerol fermentation broth, a monitoring platform for glycerol and butanol concentrations was established. The correlation coefficients were found to be 0.99074 (glycerol) and 0.99261 (butanol), respectively. The results show that the NIR rapid detection model demonstrates excellent performance with regards to accuracy and rapidity and provides a new detection method for the rapid detection of glycerol and butanol in the fermentation industry.

near-infrared spectroscopy，backward interval partial least squares，glycerol fermentation，butanol

O657.33

A

1001-8891(2020)05-0488-06

2018-10-16；

2020-03-30.

趙昇（1995-），男，江蘇常州人，碩士研究生，主要從事嵌入式系統(tǒng)開(kāi)發(fā)研究。E-mail：techmanx@163.com。

王曉榮（1972-），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)榉治鰞x器和嵌入式系統(tǒng)設(shè)計(jì)。E-mail：wang@njut.edu.cn。