羅 雯，艾佐佐，饒友生，柴學(xué)文，詹怡昕

（1.南昌師范學(xué)院 生物系，南昌330032；2.地方雞種遺傳改良省級重點實驗室／南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究所，南昌330032）

家禽腸道菌群在個體的營養(yǎng)消化吸收及生長發(fā)育方面起重要作用，個體生長速度的差異與腸道菌群組成之間存在一定關(guān)聯(lián)。體質(zhì)量相關(guān)細菌的鑒定與調(diào)節(jié)是調(diào)控體質(zhì)量的策略之一，它可能是提高禽畜生產(chǎn)效率的有效策略。

利用高通量測序技術(shù)對腸道微生物的研究表明，腸道微生物區(qū)系對宿主的代謝和生理［1］，血管生成［2］，肥胖［3-4］，免疫功能［5-7］和大腦發(fā)育［8］等均有影響。在過去的十幾年里，較多研究關(guān)注了人類和小鼠腸道微生物菌群與體質(zhì)量之間的關(guān)系，相對而言，針對家禽腸道微生物區(qū)系的相關(guān)研究較少。通過研究經(jīng)多代選擇獲得的高體質(zhì)量和低體質(zhì) 量 肉 雞 系［9］，或 高 脂 和 低 脂 肉 雞 系［10］，證 明宿主遺傳背景對腸道微生物有顯著影響，且腸道微生物參與宿主代謝，宿主和腸道菌群在基因水平的相互作用導(dǎo)致二者的協(xié)同進化。韓國學(xué)者以羅斯308雄性肉雞為研究對象［11-12］，證明體質(zhì)量不同的肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異，但顯著差異的微生物類群卻不盡相同。Lee等［11］研究揭示，低體質(zhì)量雄性肉雞盲腸中，厚壁菌門的梭菌屬顯著增加；而與高體質(zhì)量顯著相關(guān)的盲腸菌群包括變形菌門克羅諾菌屬以及厚壁菌門的3個屬。Han等［12］對試驗結(jié)果進行線性回歸分析的結(jié)果表明，在門的水平上，回腸中廣古菌門和螺旋體菌門微生物與肉雞體質(zhì)量呈正相關(guān)，屬水平上甲烷短桿菌屬和雙歧桿菌屬與肉雞體質(zhì)量正相關(guān)；而盲腸的分析結(jié)果只顯示門水平上與體質(zhì)量負相關(guān)的是疣微菌門和黏膠球形菌門，此外在屬的水平上，回腸和盲腸中疣微菌門阿克曼氏菌與肉雞體質(zhì)量呈負相關(guān)。

禽類腸道菌群的研究揭示［13-14］，腸道微生物的組成受宿主遺傳因素影響，不僅種間，甚至品種間也有明顯差異［15］。雖已發(fā)現(xiàn)肉雞長勢不同，其腸道菌群組成也有差異，但至今獲得的結(jié)果仍存在分歧，因此還需開展更多研究。寧都黃雞是中國小型優(yōu)質(zhì)肉雞的寶貴地方品種資源，利用高通量測序技術(shù)對寧都黃雞個體生長與腸道菌群相關(guān)性的系統(tǒng)研究尚未見報道。本試驗對籠養(yǎng)寧都黃公雞盲腸菌群16SrDNA 基因進行擴增子測序分析，探究個體生長速度差異與宿主盲腸微生物多樣性及組成的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

1.1.1 試驗動物 種蛋來源于贛州市寧都縣惠大集團寧都黃雞原種廠，飼養(yǎng)試驗在“江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室”家禽分子遺傳育種實踐基地（江西省南昌市南昌縣武陽鎮(zhèn)）進行。試驗起點為1 日齡雛雞苗，初始體質(zhì)量平均32g，試驗群體為200 羽寧都黃公雞，全程籠養(yǎng)育雛。飼料采用漓源飼料廠的全價料（0～6周齡育雛料，7～10周齡育成料，均無抗生素添加），自由采食與飲水。日糧營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.1.2 試驗樣品采集 在飼養(yǎng)至10周齡時稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量由高至低以等差方式分為個體數(shù)量相等的4 組，分別為極高體質(zhì)量組（L43）、次高體質(zhì)量組（L33）、次低體質(zhì)量組（L23）和極低體質(zhì)量組（L13），每組隨機抽取10羽帶回實驗室進行后續(xù)試驗。各組公雞體質(zhì)量見表2。當(dāng)天無菌采集盲腸內(nèi)容物，立即冷凍于-70 ℃冰箱，備用。

表1 日糧營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Dietary nutrition standard

表2 肉雞體質(zhì)量分布Table 2 Body mass distribution of broiler chickens

1.2 盲腸內(nèi)容物基因組DNA 的提取與測序

采用QIAamp 快速糞便DNA 提取試劑盒（QIAampFast DNA Stool Mini kit，Qiagen），根據(jù)試劑盒操作說明，提取盲腸內(nèi)容物基因組DNA 樣品。每組10個生物學(xué)重復(fù)，樣本重復(fù)提取3份，每份樣本糞便用量約0.2g。以提取的基因組DNA 為模板，采用16SrRNA 基因V3～V4高變區(qū)通用引物擴增16SrRNA V3～V4基因，引 物 序 列 為：341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′，806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。擴增程序：98 ℃變性1min，擴增30 個循環(huán)（98 ℃，10s；50 ℃，30s；72 ℃，30s），72 ℃延伸5min。用20g／L瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，對目的條帶使用Thermo Scientific公司的GeneJET 膠回收試劑盒純化。使用TruSeq○R DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，合格文庫使用HiSeq2500PE250進行上機測序，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。

1.3 微生物群落分析

在97%的相似水平下對有效數(shù)據(jù)進行操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）的聚類，并做物種注釋。使用MUSCLE［16］（Version 3.8.31，http：／／www.drive5.com／muscle／）軟件得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，后續(xù)Alpha多樣性分析基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

使用Qiime軟件（Version 1.7.0）計算Alpha多樣性指數(shù)Chaol（http：／／scikit-bio.org／docs／latest／generated／generated／skbio.diversity.alpha.chao1.html＃ skbio.diversity.alpha.chao1）、Shannon（http：／／scikit-bio.org／docs／latest／generated／generated／skbio.diversity.alpha.shannon.html＃skbio.diversity.alpha.shannon）、Simpson （http：／／scikit-bio.org／docs／latest／generated／generated／skbio.diversity.alpha.simpson.html＃skbio.diversity.alpha.simpson）、樣品覆蓋率（http：／／scikit-bio.org／docs／latest／generated／generated／skbio.diversity.alpha.goods＿coverage.html＃skbio.diversity.alpha.goods＿coverage）。使用R 軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線。

基于物種注釋結(jié)果，繪制物種相對豐度柱形圖和物種豐度聚類熱圖，獲得門和屬兩個分類水平的物種分布和豐度差異信息。

軟件分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。

1.4 組間差異細菌特征分析

使用LEfSe軟件進行線性判別分析效應(yīng)大?。↙EfSe，LDA Effect Size）檢測，將對數(shù)線性判別分析（LDA）評分閾值設(shè)為2，在LDA 評分計算過程中進行Kruskal-Wallis秩和統(tǒng)計檢驗，分析獲得在組與組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)識（Biomarker）［17］。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行處理，采用單因素ANOVA 分析組間差異，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著水平α=0.05，P＜0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對4組寧都黃雞盲腸內(nèi)容物基因組DNA 進行測序分析，各組樣品有效序列與OTU 數(shù)量見表3。單因素ANOVA 分析結(jié)果顯示，有效序列數(shù)和OTU 數(shù)量在組間無顯著差異（P＜0.05）。從樣品中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計它們所代表的OTUs，構(gòu)建稀釋曲線（圖1）。各組樣品隨機抽取的數(shù)據(jù)量達到30 000以上時，曲線已趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種（OTUs），試驗測序量足以覆蓋各樣品的大多數(shù)微生物。

表3 各組樣品有效序列與OTU 數(shù)量統(tǒng)計Table 3 Effective tags and OTU numbers of different groups

圖1 各組樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of each group

2.2 寧都黃雞盲腸菌群多樣性分析

對4 組樣本的多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）、豐富度指數(shù)（Chao1）和測序深度指數(shù)（樣品覆蓋率）進行分析（均一化時選取的數(shù)據(jù)量：cutoff=33 236），結(jié)果見表4。單因素ANOVA 分析結(jié)果顯示，Alpha多樣性指數(shù)Chaol值、Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)在組間無顯著差異（P ＜0.05）。

另外，Shannon指數(shù)曲線揭示，當(dāng)樣品測序數(shù)量超過5 500時，各組曲線已趨向平坦（圖2），結(jié)合稀釋曲線特征，進一步說明測序數(shù)據(jù)量充足，可反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息，獲得的菌群分析結(jié)果是合理且充分的。

表4 樣本多樣性分析Table 4 Diversity analysis of samples

圖2 各組樣品的Shannon指數(shù)曲線Fig.2 Shannon index curve of each group

2.3 寧都黃雞盲腸微生物菌群組成分析

對4 組寧都黃雞盲腸內(nèi)容物微生物16S rRNA 基因V3～V4區(qū)序列進行高通量測序，共鑒定出18個菌門，30個綱，51個目，84個科，179個屬和109種微生物。在盲腸細菌群落中，有3個菌門共占比90%以上，分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚 壁 菌 門（Firmicutes）和 變 形 菌 門（Proteobacteria）。其中豐度最高的是擬桿菌門，其 次 是 厚 壁 菌 門。此 外，L 4 3組 廣 古 菌 門（Eur yarchaeota）占比7.55%；L23 組疣微菌 門（Verrucomicrobia）占比2.82%，螺旋體門（Spirochaetes）占比1.77%，互養(yǎng)菌門（Synergistetes）占比1.22%；L13組互養(yǎng)菌門占比1.75%。各組腸道微生物門水平排名前10的菌群相對豐度見圖3。單因素ANOVA 分析結(jié)果顯示，變形菌門、廣古菌門、螺旋體門、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）豐度組間差異顯著（P＜0.05）。

在屬分類水平上，各組樣本中豐度最高的是擬桿菌門理研菌科（Rikenellaceae）RC9 gut group，占比16.94%～20.89%；其次是擬桿菌屬（Bacteroides），占比8.59%～14.80%。L13、L23和L33組的第三優(yōu)勢屬都是變形菌門脫硫弧菌屬（Desulfovibrio），豐度分別是7.04%、6.14%和5.80%；該屬在L43組為第四優(yōu)勢屬，占比4.14%。L43 組的第三優(yōu)勢屬是廣古菌門甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter），占比7.48%，但該菌屬在其他3 組占比均不足1%。各組腸道細菌屬水平排名前10的菌群相對豐度見圖4。單因素ANOVA 分析結(jié)果顯示，擬桿菌屬、甲烷短桿菌屬、脫硫弧菌屬、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、Ruminiclostridium 9 的 豐度組間差異顯著（P＜0.05）。

圖3 各組樣品門水平菌群相對豐度Fig.3 Relative abundance of microbial communities at phylum level of each group

雖然寧都黃雞不同體質(zhì)量組盲腸微生物群落組成具有明顯的相似性，但相對豐度卻有差異。根據(jù)所有樣品在門和屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前10的門或?qū)伲鶕?jù)其在每個樣品中的豐度信息，從物種和樣品兩個層面進行聚類，繪制成熱圖（圖5）。由圖顯示，在門水平上，廣古菌門豐度與體質(zhì)量正相關(guān)；而互養(yǎng)菌門和脫鐵桿菌門菌群豐度則與體質(zhì)量負相關(guān)；屬水平上，與體質(zhì)量呈正相關(guān)的為甲烷短桿菌屬、棲糞桿菌屬；脫硫弧菌屬、互養(yǎng)菌屬（Synergistes）則與體質(zhì)量呈負相關(guān)。

圖4 各組樣品屬水平菌群相對豐度Fig.4 Relative abundance of microbial communities at genus level of each group

圖5 樣品微生物門（A）或?qū)伲˙）水平豐度聚類熱圖Fig.5 Microbial community heatmap analysis at phylum（A）or genus（B）level

2.4 不同體質(zhì)量組間差異菌群特征分析

LEfSe分析強調(diào)統(tǒng)計意義和生物相關(guān)性，通過LEfSe算法進行組間微生物差異分析。根據(jù)LDA 值的大小判斷差異菌群的影響大小。LDA值大于2的組間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）的生物標(biāo)識中，與極高體質(zhì)量組和極低體質(zhì)量組相關(guān)的部分生物標(biāo)識豐度變化在4個體質(zhì)量組間呈現(xiàn)明顯規(guī)律性。與體質(zhì)量增長正相關(guān)的是，門水平上的廣古菌門；屬水平上包括，廣古菌門的甲烷短桿菌屬、厚壁菌門瘤胃菌科5個屬（棲糞桿菌屬、UCG 005、NK4A214group、UCG 013和Eubacterium coprostanoligenes group）、擬桿菌門另枝菌屬（Alistipes）；種水平上，Methanobrevibacter woesei的豐度從極低體質(zhì)量組的0.11%逐漸增至極高體質(zhì)量組的7.49%，唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）豐度從極低體質(zhì)量組的0.02%逐漸增至極高體質(zhì)量組的0.09%。與體質(zhì)量增長負相關(guān)的是互養(yǎng)菌門和脫鐵桿菌門；屬水平上包括互養(yǎng)菌門互養(yǎng)菌屬、變形菌門脫硫弧菌屬和嗜膽菌屬（Bilophila）、脫鐵桿菌門穆齊螺旋菌屬（Mucispirillum）、厚壁菌門3 個屬（巨球型菌屬--Megasphaera、瘤胃菌科UCG＿004和Eubacterium nodatum group）；種水平上，Mucispirillum schaedleri 豐度從極低體質(zhì)量組的0.36%逐漸下降到極高體質(zhì)量組的0.09%，產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）從極低體質(zhì)量組的0.009%至極高體質(zhì)量組未檢測出，脫硫弧菌屬的bacterium New Zealand D 豐度從極低體質(zhì)量組的1.15%逐漸下降到極高體質(zhì)量組的0.38%。

與體質(zhì)量增長正或負相關(guān)生物標(biāo)識中相對豐度＞1%的19 個生物標(biāo)識信息見表5。在這19個生物標(biāo)識中，種（或?qū)伲┧缴系纳飿?biāo)識在不同組中豐度比較見圖6。相對豐度低于1%的生物標(biāo)識未逐一列出。

表5 基于LEfSe分析的不同體質(zhì)量雄性寧都黃雞盲腸細菌群落差異Table 5 Cecal bacterial community differences of male Ningdu Huang chickens with different body mass based on Linear Discriminant Analysis Effect Size（LEfSe）

3 討 論

動物腸道內(nèi)存在一個復(fù)雜而龐大的微生物群落，它在許多方面影響著宿主的健康和生長［3，18］。為進一步了解腸道微生物菌群在肉雞生長過程中發(fā)揮的作用，本研究以寧都黃雞為試驗對象，將飼養(yǎng)10周的公雞按照體質(zhì)量分組，分析不同體質(zhì)量組盲腸微生物的組成特點。

3.1 不同體質(zhì)量寧都黃雞盲腸菌群豐度和多樣性比較

圖6 生物標(biāo)識組間豐度比較圖Fig.6 Comparative graph of relative abundance of biomarkers among groups

多項研究顯示腸道微生物多樣性與宿主體質(zhì)量 增長呈負相 關(guān)［3，12，19］。針 對 魚 類 的 研 究 顯 示 生長緩慢組的魚腸道菌群豐富度和多樣性都顯著高于正常組，推測該變化源于健康狀況下生長被抑制的菌群過度繁殖［20］。但在本研究中，按體質(zhì)量遞增劃分的4組樣本，雖然體質(zhì)量差別已經(jīng)超過80%，其盲腸微生物豐富度和多樣性卻無顯著差異，可見，腸道微生物的多樣性并非與體質(zhì)量增長速率必然相關(guān)，可能僅是在特定健康狀況下的一種變化。

3.2 門和屬水平上不同體質(zhì)量寧都黃雞盲腸菌群組成特征

對雞腸道微生物16SrDNA 測序結(jié)果的分析表明［13，21-22］，門水平上豐度較高的是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門（＞90%），對寧都黃雞盲腸菌群的研究獲得類似結(jié)果，差別在于豐度最高的是擬桿菌門，而非其他研究［22-24］結(jié)論中的厚壁菌門。屬水平上，已有報道揭示梭狀芽孢桿菌、瘤胃球菌、乳桿菌和擬桿菌屬是雞腸道的主要菌群［21-22］；但本研究結(jié)果卻存在較大差異，各體質(zhì)量組豐度最高的是理研菌科RC9gut group，其次是擬桿菌屬，而梭狀芽孢桿菌屬和乳桿菌屬占比較低。在試驗中出現(xiàn)這些差異的原因可能主要與飼料成分有關(guān)。已有研究報道［25］，飼料成分影響到雞消化道的微生物群，特別是在消化道下段，高纖維和低脂飲食增加了擬桿菌門的數(shù)量，而低纖維和高脂肪飲食則增加了雞消化道微生物群中厚壁菌門的數(shù)量。

3.3 不同體質(zhì)量寧都黃雞盲腸差異菌群

雖有部分研究［9-12］分析了肉雞體質(zhì)量差異與腸道菌群之間的相關(guān)性，但分析獲得的相關(guān)微生物類群卻各不相同。在已有同類研究中，大多只設(shè) 置 體 質(zhì) 量 顯 著 不 同 的2 個 組［9-10，12］或3 個組［11］。本研究設(shè)置體質(zhì)量逐級變化的4個組，在菌群差異分析時，不僅考慮分組兩兩比較時菌群豐度的變化，也兼顧4個體質(zhì)量組間菌群差異是否同樣呈現(xiàn)規(guī)律性變化，有助于準(zhǔn)確判斷菌群豐度變化是否和體質(zhì)量變化相關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果顯示，廣古菌門菌群豐度與體質(zhì)量增長正相關(guān)，在針對羅斯308 肉雞的研究中［12］，回腸部分析得出相同結(jié)論。對體質(zhì)量增長影響最大的屬是廣古菌門的甲烷短桿菌屬，在動物腸道中，它們是主要的產(chǎn)甲烷菌，并有助于纖維素的消化［26］。本次測序分析結(jié)果顯示，甲烷短桿菌屬的Methanobrevibacter woesei是影響體質(zhì)量變化的主要菌種，其豐度從極低體質(zhì)量組的0.11%顯著增至極高體質(zhì)量組的7.49%，該菌種已在大鼠和家禽腸道分離獲得［26-27］，并被證明是雞盲腸產(chǎn)甲烷菌中的優(yōu)勢種［28］。結(jié)合本次研究和其他分析結(jié)果［12］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料成分為高纖維低脂型，該屬細菌則表現(xiàn)出與體質(zhì)量增長正相關(guān)；而使用同樣肉雞品種，飼料改為低纖維高脂型時，就沒有檢測到該菌群與高體質(zhì)量組的相關(guān)性［11］。因此，推測在使用高纖維低脂型飼料時，該屬細菌對飼料的消化吸收起到顯著促進作用，因而促進體質(zhì)量的增加。

在屬水平上，與本研究結(jié)果相似，棲糞桿菌屬和另枝菌屬與高體質(zhì)量肉雞的相關(guān)性在羅斯308肉雞研究中也有報道［11］。棲糞桿菌屬是一類丁酸產(chǎn)生菌［29］，另枝菌屬則可以發(fā)酵產(chǎn)生乙酸［30］、琥珀酸［31］，哺乳動物試驗表明，這些短鏈脂肪酸（尤其是丁酸鹽），可作為小腸上皮細胞的重要能源［32］，并通過促進細胞分化、促進緊密連接或上調(diào)胰高血糖素基因在腸道L 細胞中的表達來改善腸道屏障功能［31］。此外，另枝菌屬還具有產(chǎn)生纖溶酶和消化明膠的能力［30］。因此，這兩個菌群可能通過改善腸道功能促進消化吸收，進而促進肉雞的生長。

雖然在本研究中對體質(zhì)量影響最大的負相關(guān)菌群是變形菌門脫硫弧菌屬，但在其他研究中卻認為該菌群屬于有益菌［30，33］，因為脫硫弧菌在雞的盲腸生態(tài)系統(tǒng)中充當(dāng)氫庫的角色，而氫會抑制短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。哺乳動物腸道菌群研究的結(jié)果卻有所不同，由于該菌群是內(nèi)毒素產(chǎn)生菌，且可以將硫酸鹽還原成硫化物，對上皮細胞產(chǎn)生毒性，并且是潰瘍性結(jié)腸炎的病因之一［34-35］，因此被認為是有害菌群［36］。雖然關(guān)于脫硫弧菌對腸道功能的影響依然存在爭議，但本研究再次驗證了該菌群對肉雞生長的不利影響。

綜上分析，雖然需要對微生物群與體質(zhì)量之間的關(guān)系進行更多的研究，但這些細菌群可用于改善肉雞的生長性能。另外，通過功能推斷分析，對不同細菌類群的代謝過程深入了解，可能擴展對雞消化道微生物群的認識。

4 結(jié) 論

日齡相同而體質(zhì)量顯著差異的寧都黃雞盲腸菌群豐富度及多樣性無顯著差異，但菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。廣古菌門甲烷短桿菌屬和厚壁菌門棲糞桿菌屬菌群豐度與體質(zhì)量正相關(guān)，且對寧都黃雞生長起到主要促進作用。其中，甲烷短桿菌屬的Methanobrevibacter woesei可能是促進寧都黃雞生長的主要菌群之一。屬水平上，對體質(zhì)量產(chǎn)生主要影響的負相關(guān)菌群是變形菌門脫硫弧菌屬和互養(yǎng)菌門互養(yǎng)菌屬。其中，脫硫弧菌屬Bacterium New Zealand D 菌在盲腸內(nèi)豐度的增加可能導(dǎo)致寧都黃雞生長減緩。