劉濤，李鵬程，劉正湘，左后娟

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院，武漢430000；2華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院

肝癌是國內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是患者死亡的主要原因之一[1]。CD151是四跨膜蛋白超家族(TM4SF)的重要成員，也是與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)最為密切的TM4SF分子[2]，被認(rèn)為是調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移重要的分子之一。CD151能夠與整合素相結(jié)合，再銜接其他TM4SF分子與整合素作用，將多種細(xì)胞外生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞的伸展、遷移、黏附、腫瘤侵襲等過程[3]。研究顯示，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CD151-整合素α3表達(dá)陽性率明顯升高，CD151和整合素α3陽性表達(dá)在結(jié)腸癌患者中呈正相關(guān)性[4]；而CD151/整合素β1均陽性的肝癌患者3、5、7年總體生存率明顯低于CD151/整合素β1陰性的患者[5]。因此，CD151、CD151/整合素β1被認(rèn)為是判斷肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。局部黏著斑激酶(FAK)與腫瘤侵襲高度相關(guān)，F(xiàn)AK-Src-paxillin信號(hào)通路除了作為整合素重要的信號(hào)通路外，也被認(rèn)為是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、生長和侵襲的重要通路之一。FAK、Src、paxillin的磷酸化是FAK-Src-paxillin信號(hào)通路激活的標(biāo)志，在結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制中均有報(bào)道[6，7]。雖然研究報(bào)道CD151高表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲，但其分子機(jī)制尚不清楚。2018年3月～2019年5月，我們將CD151及其整合素結(jié)合突變體(CD151-mut)轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，觀察CD151及CD151-mut對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響，并探討其與FAK-Src-paxillin通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自武漢大學(xué)物種保藏中心。pAAV-CD151質(zhì)粒由美國俄克拉荷馬大學(xué)健康中心張欣教授惠贈(zèng)。pAAV-CD151-AAA(即CD151-AAA194-196突變質(zhì)粒)由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[8，9]。FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自瑞士Roche Group公司，胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑和免疫共沉淀試劑盒購自美國Pierce公司，抗CD151小鼠抗人抗體由張欣教授惠贈(zèng)，F(xiàn)AK、Src、paxillin及磷酸化抗體，二抗購自美國Cell signaling公司，單克隆抗整合素α3、α6、β1小鼠抗人抗體購自美國CST公司。熒光倒置顯微鏡購自NIKON公司、臺(tái)式高速低溫離心機(jī)購自美國Beckman公司，微量紫外分光光度計(jì)、Bio-RAD電泳儀購自美國Bio-RAD公司，微型離心機(jī)購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至60%融合后，接種于至6孔板中，更換Opti-MEM培養(yǎng)基，37 ℃預(yù)孵育30 min。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、CD151組和CD151-mut組。對(duì)照組加入6 μL生理鹽水，其他組加入6 μL FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑，CD151組和CD151-mut組再分別加入pAAV-CD151質(zhì)粒或pAAV-CD151-AAA質(zhì)粒各2 μg，孵育4 h后，去除培養(yǎng)基，更換含10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。收集各組細(xì)胞，加入胰酶消化，離心，用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為(2～3)×105/mL。預(yù)先用Matrigel鋪小室，置入Transwell板中。無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞外基質(zhì)包被膜，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入小室下層，各組細(xì)胞懸液分別加入Transwell小室中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取聚碳酸酯膜，擦去膜上層未遷移的細(xì)胞，甲醇固定濾膜及下層細(xì)胞，龍膽紫染色。顯微鏡(×200)下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，取平均值。

1.5 CD151及FAK-Src-paxillin通路活性檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞加入預(yù)冷的PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解后，從平板上刮下細(xì)胞，提取蛋白并檢測各組濃度。分別取各組蛋白(約40 μg)在SDS-PAGE凝膠上電泳并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。分別加入一抗(鼠抗人CD151、FAK、Src、paxillin、p-FAK、p-Src、p-paxillin、β-actin)4 ℃孵育過夜。洗滌后，與相應(yīng)的二抗孵育約2 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯色、曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)(Image J軟件)分析各組目的條帶。CD151蛋白表達(dá)以β-actin蛋白表達(dá)量為內(nèi)參；p-FAK、p-Src、p-paxillin蛋白表達(dá)分別以FAK、Src、paxillin作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量表示該通路的活性。

1.6 CD151與整合素α3、α6、β1結(jié)合情況觀察 采用免疫共沉淀法。取CD151組、CD151-mut組、對(duì)照組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，加入RIPA裂解緩沖液，4 ℃裂解30 min。裂解物于4 ℃ 13 000 g離心10 min，去除沉淀，保留上清液。取細(xì)胞裂解液加入已包被一抗的蛋白A(CD151的抗體1 μg)和蛋白G瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜；4 ℃離心5 min。去上清，緩沖液洗滌免疫復(fù)合物，加入laemmli樣品緩沖液中溶解。取各組樣品分別于SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離。檢測各組CD151結(jié)合整合素α3、α6、β1蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞侵襲能力比較 對(duì)照組、CD151組和CD151-mut組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(106±4)、(165±7)、(98±2)個(gè)。CD151組穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增加，CD151-mut組穿膜細(xì)胞數(shù)較CD151組減少(P均<0.05)。

2.2 三組CD151表達(dá)量比較 CD151組、CD151-mut組、對(duì)照組CD151蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為2.17±0.18、2.31±0.23、1.09±0.14。CD151組和CD151-mut組較對(duì)照組升高(P均<0.01)，CD151-mut組與CD151組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 三組FAK-Src-paxillin通路活性比較 CD151組p-FAK、p-Src、p-paxillin蛋白表達(dá)量較對(duì)照組增加，CD151-mut組p-FAK、p-Src、p-paxillin蛋白表達(dá)量較CD151組降低(P均<0.05)。見表1。

表1 三組FAK-Src-paxillin通路活性比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與CD151組相比，#P<0.05。

2.4 三組結(jié)合整合素水平比較 CD151與整合素α3、α6和β1結(jié)合形成復(fù)合體，CD151組結(jié)合整合素α3、α6、β1水平高于對(duì)照組(P均<0.05)，而CD151-mut組結(jié)合整合素α3、α6、β1水平低于CD151組(P均<0.01)。見表2。

表2 三組結(jié)合整合素水平比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與CD151組相比，#P<0.01。

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤，其病因多樣、惡性程度高、預(yù)后差，是我國第2位的腫瘤死亡原因。肝癌的手術(shù)切除治療是首選方法，早期切除肝癌患者的5年生存率可達(dá)60%以上。部分患者在明確診斷時(shí)已經(jīng)失去根治性切除的機(jī)會(huì)，全肝切除和肝移植治療能夠挽救部分患者，但其高昂的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)成為患者不能承受之重。早期發(fā)現(xiàn)肝癌、研究其侵襲特性成為近年來研究的熱點(diǎn)。CD151是最早發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)的四跨膜蛋白,是四跨膜網(wǎng)絡(luò)形成最為關(guān)鍵的分子之一，與整合素關(guān)系密切，CD151在肝癌、肺癌等腫瘤中廣泛表達(dá)，且與腫瘤惡性進(jìn)展以及預(yù)后均密切相關(guān)。Zevian等[10]報(bào)道，CD151在原發(fā)性肝細(xì)胞癌肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織及正常組織；CD151過表達(dá)與肝癌患者的無包膜、高分期與分級(jí)、腫瘤細(xì)胞低分化、有門脈癌栓及多衛(wèi)星灶等臨床病理因素有關(guān)。腫瘤侵襲是惡性腫瘤細(xì)胞從其起源部位沿組織間隙向周圍組織浸潤的過程，腫瘤細(xì)胞突破基底膜是腫瘤擴(kuò)散的第一步。

腫瘤細(xì)胞的侵襲是影響惡性腫瘤預(yù)后的重要因素，Ke等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD151的肝癌細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。CD151如何介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲是目前研究的熱點(diǎn)。Zhang等[3]報(bào)道，CD151參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)黏附并促進(jìn)新生血管生成，這可能是其促進(jìn)腫瘤侵襲的機(jī)制之一。本研究通過轉(zhuǎn)染CD151質(zhì)粒上調(diào)肝癌細(xì)胞中CD151的表達(dá)，CD151-mut僅是CD151基因序列中的AAA194-196突變，并不影響CD151蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，CD151組與CD151-mut組在CD151蛋白表達(dá)水平上無差異；在肝癌細(xì)胞侵襲能力方面，CD151組穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增加，CD151-mut組穿膜細(xì)胞數(shù)較CD151組減少。表明CD151高表達(dá)可提高肝癌細(xì)胞的侵襲能力，CD151基因突變在不改變CD151蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上可以影響CD151的功能。

在促腫瘤侵襲的分子信號(hào)機(jī)制的研究方面，整合素是位于細(xì)胞表面的異二聚體黏著受體,與胞外基質(zhì)蛋白相結(jié)合,由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成,α3β1和α6β1是層黏連蛋白連接整合素，可以與四跨膜超家族蛋白形成復(fù)合體。CD151是四跨膜超家族蛋白的最重要成員之一，它可以通過胞外大環(huán)特異性位點(diǎn)QRD194-196與整合素α3β1或α6β1相連，形成CD151-α3β1/α6β1復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，是整合素依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)分子，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，是腫瘤細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵[12]。FAK磷酸化后，將上游信號(hào)整合并傳遞下去，調(diào)控細(xì)胞骨架重組、收縮、黏著斑解聚與形成，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。Kohno等[13]報(bào)道，向小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD151后，細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，但該效應(yīng)可被CD151抗體所抑制。Yue等[14]對(duì)CD151-整合素復(fù)合體的研究發(fā)現(xiàn)，CD151可使促進(jìn)FAK磷酸化。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞中，CD151能夠促進(jìn)FAK磷酸化增強(qiáng)[8]。本研究結(jié)果證實(shí)，CD151可使FAK磷酸化加強(qiáng)，CD151-mut組的FAK磷酸化受阻。FAK-Src-paxillin通路是整合素重要的信號(hào)通路，F(xiàn)AK、Src、paxillin磷酸化是該信號(hào)通路激活的標(biāo)志，是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、生長和侵襲的重要通路。

Mantonakis等[15]報(bào)道，F(xiàn)AK、Src、paxillin高表達(dá)與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)。但FAK-Src-paxillin信號(hào)通路是否介導(dǎo)CD151在肝癌中的作用并未見報(bào)道。本研究分別檢測了CD151和CD151-mut轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后對(duì)FAK、Src、paxillin表達(dá)的影響，結(jié)果顯示CD151高表達(dá)促進(jìn)FAK、Src、paxillin的磷酸化，且轉(zhuǎn)染CD151-mut突變體未導(dǎo)致FAK、Src、paxillin的磷酸化蛋白表達(dá)增加。CD151-mut組與CD151組兩組肝癌在細(xì)胞侵襲上的功能差異與CD151基因的突變導(dǎo)致的FAK、Src、paxillin磷酸化差異相關(guān)，提示CD151促肝癌細(xì)胞侵襲作用與FAK-Src-paxillin信號(hào)通路相關(guān)，其通過促進(jìn)FAK、Src、paxillin蛋白的磷酸化程度，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

CD151是整合素重要的關(guān)聯(lián)蛋白，在結(jié)構(gòu)上具有特異性。其通過細(xì)胞外大環(huán)特異性位點(diǎn)QRD194-196，與多種整合素亞基結(jié)合，其中最主要的是整合素α3、α6、β1，形成相當(dāng)牢固且極其穩(wěn)定的CD151-整合素復(fù)合體[16]，該復(fù)合體的形成是跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要前提條件[17]。破壞該復(fù)合體的形成后，內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲能力、管狀結(jié)構(gòu)形成的能力均明顯減弱[18]。本研究結(jié)果顯示，CD151-mut突變體可破壞CD151與整合素α3、α6、β1的結(jié)合，但該突變體并不影響CD151蛋白表達(dá)。CD151突變體轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的侵襲能力較CD151明顯減弱，提示CD151和整合素結(jié)合是介導(dǎo)其促肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的重要機(jī)制。

綜上所述，CD151和整合素復(fù)合體形成是促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的重要條件，破壞該復(fù)合體形成則減弱CD151的促侵襲效應(yīng)，CD151促肝癌細(xì)胞侵襲的作用機(jī)制是通過FAK-Src-paxillin信號(hào)通路的磷酸化產(chǎn)生效應(yīng)的。