李順來，姜亭起，馬天加

1濟南市第五人民醫(yī)院，濟南250022；2山東大學第二醫(yī)院

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中以膀胱尿路上皮癌所占比例最大。雖然放化療以及靶向藥物的應用改善了早期膀胱癌患者的預后，但對于中晚期患者而言，腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移率高，預后仍然較差；此外，化療耐藥也是導致膀胱癌治療效果不理想的另一個重要原因。研究證實，腫瘤干細胞是腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移以及耐藥的主要原因[1]，然而其具體機制尚未完全闡明。探討膀胱癌干細胞在膀胱癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移中的機制，對于降低中晚期患者的復發(fā)轉(zhuǎn)移率、改善預后極為重要。趨化因子受體2(CXCR2)是趨化因子受體家族中的一員，是CXC陽性趨化因子的公共受體[2]。CXCR2在腎癌、乳腺癌以及胰腺癌等腫瘤中均出現(xiàn)差異表達，且通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、血管形成等促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[3]。近年研究顯示，CXCR2在腫瘤干細胞的增殖以及侵襲、轉(zhuǎn)移中亦起著關(guān)鍵調(diào)控作用[4]。2017年10月～2019年2月，我們從膀胱癌組織中提取、培養(yǎng)腫瘤干細胞，采用慢病毒技術(shù)沉默干細胞中CXCR2基因的表達，觀察其對細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 膀胱癌干細胞的組織來源 收集1例膀胱尿路上皮癌患者的新鮮腫瘤組織。納入標準：①首次手術(shù)經(jīng)病理證實為膀胱尿路上皮癌；②術(shù)前未接受過放化療以及內(nèi)分泌治療；③除膀胱癌以外，無其他惡性腫瘤病史；④無肝腎功能障礙以及傳染病史。本研究經(jīng)濟南市第五人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者簽署知情同意書。

1.2 膀胱癌干細胞的分離鑒定與CXCR2蛋白檢測 將新鮮腫瘤組織置于超凈工作臺內(nèi)，去除脂肪、血管等非腫瘤組織，用眼科剪將腫瘤組織剪碎，加入1 mg/mL Ⅳ型膠原酶，37 ℃搖床上消化2 h。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，用70 μm孔徑的細胞篩網(wǎng)過濾，2 000 r/min離心5 min，棄上清。加入含有表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的無血清培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察，2周左右開始形成懸浮細胞球，采用流式細胞儀分選CD44+膀胱癌干細胞，其余細胞標注為CD44-細胞，接種于無血清培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。采用Western blotting法檢測CD44+與CD44-細胞的干細胞標志基因Oct4、Sox2蛋白表達，并檢測CXCR2蛋白表達。

1.3 膀胱癌干細胞的培養(yǎng)與分組、轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細胞，接種至6 cm培養(yǎng)皿中。將細胞分為sh-CXCR2組和sh-scramble組，sh-CXCR2組加入慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與CXCR2敲減慢病毒sh-scramble組加入慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與對照scramble按照轉(zhuǎn)染說明書操作。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 膀胱癌干細胞增殖能力觀察 采用MTS法。取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，以2×103/孔接種于96孔板中。將細胞分為sh-CXCR2組和轉(zhuǎn)染對照組，每組設(shè)6個復孔。按照“1.3”方法進行慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后，每孔更換150 μL新鮮培養(yǎng)基并加入30 μL MTS工作液，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，酶標掃描儀490 nm波長處測定吸光度值，細胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.5 膀胱癌干細胞克隆形成能力觀察 采用軟瓊脂克隆形成實驗。1.2%瓊脂糖高溫高壓滅菌后放入42 ℃水浴中，加入等體積無血清培養(yǎng)基混勻，取2 mL瓊脂糖與無血清培養(yǎng)基混合液均勻鋪至6 cm培養(yǎng)皿中做為底層膠，放置4 ℃冰箱中冷卻至固態(tài)。按照“1.3”的方法對膀胱癌細胞進行分組、轉(zhuǎn)染。將2 mL高溫滅菌后的0.6%瓊脂糖與無血清培養(yǎng)基等體積混勻做為上層膠，取轉(zhuǎn)染72 h的膀胱癌干細胞以3×104/孔、100 μL培養(yǎng)基與37 ℃預熱的上層膠充分混勻，鋪至固態(tài)的底層膠上，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～16 d，顯微鏡下觀察，計數(shù)克隆球的形成數(shù)目并拍照。

1.6 膀胱癌干細胞凋亡率測算 細胞轉(zhuǎn)染72 h后，加入無EDTA的胰酶消化。PBS洗3次，按照說明書分別加入Binding Buffer、7-ADD、Annexin Ⅴ-APC染液。槍頭吹吸混勻后避光孵育10～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7 膀胱癌干細胞轉(zhuǎn)移能力觀察 采用Transwell轉(zhuǎn)移實驗。細胞轉(zhuǎn)染72 h后，加入無EDTA的胰酶消化制成單細胞懸液，聚碳酸酯微孔膜(孔徑8 μm)分布于運動小室和侵襲小室的上下室之間，下室加入500 μL含體積分數(shù)為10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，上室加入5×104個細胞，37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 h。顯微鏡觀察下室有明顯細胞時終止實驗，取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定，蘇木精染色。光鏡下觀察穿膜細胞數(shù)，隨機計數(shù)5個視野取平均值。

1.8 膀胱癌干細胞侵襲能力觀察 采用Boyden侵襲實驗。將“1.7”中的聚碳酸酯微孔膜侵襲小室濾膜上包被人工基底膠，其余步驟同上。

1.9 膀胱癌干細胞抗凋亡相關(guān)蛋白FOXO1A、Bcl-2及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達檢測 采用Western blotting法。細胞轉(zhuǎn)染72 h后，加入RIPA細胞裂解液裂解，用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸后-20 ℃保存?zhèn)溆谩DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜，8%脫脂奶粉封閉3 h。分別加入FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9一抗(稀釋濃度均為1∶500)孵育過夜，加入兔二抗和鼠二抗(稀釋濃度均為1∶8 000)孵育2 h，TBST洗滌3次，化學發(fā)光底物曝光條帶，Image J軟件分析條帶光密度。以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白與GAPDH光密度比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌干細胞的篩選鑒定結(jié)果及CXCR2蛋白表達情況 經(jīng)流式細胞儀篩選出的CD44+膀胱癌干細胞約占全部細胞的2.37%。CD44+膀胱癌干細胞中Oct4、Sox2、CXCR2蛋白表達均高于CD44-細胞(P均<0.05)，見表1。

表1 CD44+與CD44-膀胱癌干細胞中Oct4、Sox2、CXCR2蛋白表達比較

注：與CD44-細胞比較，#P<0.05。

2.2 兩組細胞增殖率比較 sh-CXCR2組細胞增殖率為100%±1.54%，轉(zhuǎn)染對照組為48.41%±2.11%，sh-CXCR2組細胞增殖率低于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。

2.3 兩組克隆形成能力比較 轉(zhuǎn)染對照組克隆球形成數(shù)目為(23.47±1.97)個，sh-CXCR2組為(6.36±1.21)個，sh-CXCR2組克隆球形成數(shù)目少于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 sh-CXCR2組細胞凋亡率為7.41%±0.24%，轉(zhuǎn)染對照組為0.87%±0.18%，sh-CXCR2組細胞凋亡率高于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。

2.5 兩組細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力比較 Transwell實驗結(jié)果顯示，sh-CXCR2組穿膜細胞數(shù)為(33.17±5.48)個，轉(zhuǎn)染對照組為(249.38±9.57)個，sh-CXCR2組少于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。Boyden實驗結(jié)果顯示，sh-CXCR2組穿膜細胞數(shù)為(53.18±8.21)個，轉(zhuǎn)染對照組為(153.12±11.26)個，sh-CXCR2組少于轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05)。

2.6 兩組細胞FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達比較 見表2。

表2 兩組細胞中FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達比較

3 討論

膀胱癌包括肌層浸潤性膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌以及轉(zhuǎn)移性膀胱癌，3類膀胱癌的治療手段和預后均相差甚遠。早期非肌層浸潤性膀胱癌多采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后膀胱內(nèi)灌注化療，而對于肌層浸潤以及轉(zhuǎn)移性膀胱癌多采用全膀胱切除術(shù)聯(lián)合化療治療，但其復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較高，預后極差[5]。研究顯示，膀胱癌患者術(shù)后復發(fā)率高達48%～70%，且將近半數(shù)患者術(shù)后會發(fā)生惡性進展或遠處轉(zhuǎn)移[6]，給膀胱癌的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。新近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞是導致腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因[7]。腫瘤干細胞具有很強的自我更新和持續(xù)增殖能力，且具有多項分化潛能，在腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤干細胞的存在是腫瘤無法根治的關(guān)鍵因素，闡明腫瘤干細胞致癌的具體機制將為腫瘤治療提供新的策略。有學者發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中存在膀胱癌干細胞[8]，但其在膀胱癌發(fā)病中的作用及機制尚不明確。

CXCR2編碼基因位于2q35，由約350個氨基酸組成，屬于G蛋白偶聯(lián)受體。其結(jié)構(gòu)域包含有胞內(nèi)端與胞外端，N末端位于胞外端，是趨化因子配體結(jié)合區(qū)；C末端位于胞內(nèi)端，是將胞外信號活化并繼續(xù)向下傳遞的關(guān)鍵區(qū)域[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，CXCR2在腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Ignacio等[10]報道，CXCR2可通過調(diào)控P21抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖。Cui等[11]報道，CXCR2可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Huang等[12]報道，CXCR2可增強腎癌細胞的干樣特性。Wang等[13]認為，CXCR2可能是一個新的干細胞標記物，CXCR2可通過CXCR2-Src-PKL/Vav2-Rac1促進間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞遷移[14]，推測CXCR2可能通過調(diào)控膀胱癌干細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移而促進膀胱癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移。本研究采用原代培養(yǎng)技術(shù)分離CD44+膀胱癌干細胞，采用Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)CXCR2在膀胱癌干細胞中呈高表達。為了進一步研究CXCR2在膀胱癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移中的作用，我們將慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與CXCR2敲減慢病毒轉(zhuǎn)染至膀胱癌干細胞中，觀察沉默CXCR2基因表達對細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果顯示，sh-CXCR2組細胞增殖能力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。表明CXCR2可以促進膀胱癌干細胞增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移。

最新研究發(fā)現(xiàn)，CXCR2可通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白如CDK4、CDK6促進細胞周期進程，通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2抑制細胞凋亡[15]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，Bcl-2凋亡信號通路是線粒體途徑引發(fā)的細胞凋亡，在細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。細胞凋亡信號經(jīng)胞質(zhì)傳遞至線粒體，并通過BH結(jié)構(gòu)域與線粒體膜上的Bcl-2蛋白結(jié)合，降低Bcl-2的抗凋亡作用[16]。FOXO1A是叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOX家族的重要一員，參與調(diào)控細胞氧化應激、DNA損傷以及細胞凋亡等多種生物學過程。FOXO1A是Bcl-2上游的調(diào)節(jié)因子，CXCR2可能是通過FOXO1A/Bcl-2通路，調(diào)控細胞凋亡進程促進惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，沉默CXCR2基因表達后，sh-CXCR2組FOXO1A、Bcl-2蛋白表達均降低。提示CXCR2可通過調(diào)控FOXO1A通路抑制膀胱癌干細胞凋亡，促進其增殖。

MMP-2和MMP-9屬于MMP家族成員，其主要作用是降解細胞外基質(zhì)。與其他MMP相比，MMP-2催化區(qū)含有半胱氨酸嵌入物，在與膠原蛋白以及彈力蛋白結(jié)合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MMP-9位于20q11.1～13.1上，其含有一個O-糖基化的膠原蛋白V樣嵌入物，促進MMP-9與血紅素樣區(qū)結(jié)合。目前研究已經(jīng)證實，MMP-2以及MMP-9在腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管形成以及免疫調(diào)節(jié)等過程中均起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，沉默CXCR2基因表達后，sh-CXCR2組MMP-2、MMP-9表達均降低。提示CXCR2可通過調(diào)控MMP-2、MMP-9的表達促進細胞侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，CXCR2在膀胱癌干細胞中呈高表達，沉默其表達可以降低膀胱癌干細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，促進細胞凋亡，其機制可能是通過作用于凋亡相關(guān)蛋白FOXO1A、Bcl-2，調(diào)控凋亡通路進而促進腫瘤生長，通過調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達進而調(diào)控細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。該研究為治療膀胱癌提供了新的策略，CXCR2可能成為膀胱癌治療的潛在靶點。