宋廷富，廖勤儉，周韓玲，安明哲，李楊華，王 芳，郭 艷，王小琴，羅 珠

（宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓 644007）

β-內(nèi)酰胺類抗生素屬于抗生素大家族中的一員，主要包括頭孢菌素類和青霉素類兩大類，其基本結(jié)構(gòu)具有一個(gè)四元β-內(nèi)酰胺環(huán)通過(guò)N 原子與一個(gè)五元或六元環(huán)稠合。β-內(nèi)酰胺類抗生素具有極強(qiáng)的抗菌作用，普遍用于獸醫(yī)藥治療，也可以添加到動(dòng)物飼料中預(yù)防牲畜疾病[1]。隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素被大量頻繁的使用，水環(huán)境中抗生素含量急劇增加，將會(huì)對(duì)環(huán)境造成很大的危害。為了評(píng)估抗生素對(duì)釀酒環(huán)境的影響，因此建立一種水環(huán)境中抗生素高效、快速的檢測(cè)方法成為了當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

由于水中目標(biāo)分析物含量較低，因此樣品的前處理技術(shù)非常關(guān)鍵。常用的前處理技術(shù)包括固相萃取技術(shù)（SPE）[2-3]、固相微萃取技術(shù)（SPME）[4]、基質(zhì)固相萃取技術(shù)（MSPD）[5]和免疫親和色譜法（IAC）[6]等。其中固相萃取技術(shù)具有便捷、高效且能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化處理的優(yōu)勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)對(duì)水樣進(jìn)行前處理。該系統(tǒng)能同時(shí)處理6 個(gè)樣品，自動(dòng)連續(xù)處理60 個(gè)樣品，極大地提高了前處理工作效率。

目前檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素的方法有高效液相色譜法（HPLC）[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）[9-12]、高效毛細(xì)管電泳（HPCE）[13]、高效薄層色譜法（HPTLC）[14]等。由于LC-MS/MS 技術(shù)具有高靈敏度、低檢測(cè)限特性，被廣泛應(yīng)用于抗生素分析。本研究采用全自動(dòng)固相萃取技術(shù)作為前處理技術(shù)，結(jié)合LC-MS/MS 檢測(cè)分析，通過(guò)優(yōu)化前處理過(guò)程，建立了釀酒水環(huán)境中6 種β-內(nèi)酰胺類抗生素的分析方法，為高效、快速分析釀酒環(huán)境中的抗生素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：生產(chǎn)用水，五糧液股份有限公司提供。

試劑耗材：HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL，美國(guó)waters公司）；甲醇（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Merck公司）；檸檬酸（分析純）；Na2EDTA(分析純)；磷酸氫二鈉（分析純）；甲酸(色譜級(jí)，美國(guó)fisher 公司)；β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：青霉素V 鉀、頭孢噻肟鈉鹽92 %、頭孢噻呋99 %、鄰氯青霉素鈉99 %、雙氯青霉素·H2O 98%、頭孢匹林（均購(gòu)于百靈威試劑公司）。

儀器設(shè)備：5500 系列三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀和Xksper110 系列高效液相色譜儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；AutoEVA-60 全自動(dòng)平行濃縮儀，?？乒?；FotectorPlus-60 全自動(dòng)固相萃取儀，睿科公司；5810R 冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendof 公司；振蕩器，德國(guó)IKA 公司；十萬(wàn)分之一天平，梅特勒-托利多公司；超純水制備儀，美國(guó)Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取各β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇溶液配制成50 mL 濃度為1000 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置于-20 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A 相為超純水(含0.1 %甲酸），B相為甲醇；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0～5 min，90%～2%A；5～9 min，2%A；9～11 min，2%～90%A；11～15 min，90%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：5500 V；氣簾氣：30 psi；碰撞氣：8 psi；離子源溫度：550 ℃；加熱氣1:55 psi；加熱氣2:55 psi。6 種β-內(nèi)酰胺類抗生素的碰撞電壓及其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 β-內(nèi)酰胺類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

1.2.3 樣品預(yù)處理

水樣預(yù)處理：取生產(chǎn)用水200 mL，加入EDTAMcIlvaine 緩沖溶液（pH4.0，10 mL，0.1 mol/L）調(diào)節(jié)水樣的pH4.0，加入硫代硫酸鈉50 mg，加入標(biāo)準(zhǔn)品5 μg/L過(guò)柱。

水樣富集與凈化：詳細(xì)的固相萃取流程見表2。洗脫的樣品在35 ℃，3.5 psi 條件下氮吹濃縮至近干，用20 %甲醇定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm 濾膜待測(cè)。

表2 Fotector Plus對(duì)水中β-內(nèi)酰胺類抗生素的固相萃取富集方法

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的優(yōu)化

固相萃取小柱會(huì)對(duì)最終的加標(biāo)回收率產(chǎn)生很大的影響，考慮到目標(biāo)化合物的性質(zhì)，參考已發(fā)表文獻(xiàn)，選取waters 公司的HLB 柱作為固相萃取小柱。對(duì)比3種HLB小柱（60 mg/3 mL；200 mg/6 mL；500 mg/6 mL）的回收效果，在250 mL 水樣時(shí)，保證加標(biāo)回收率和節(jié)約成本的情況下，60 mg/3 mL 的HLB柱能滿足要求。

2.1.2 固相萃取裝置的選擇及參數(shù)優(yōu)化

水樣的前處理步驟繁瑣耗時(shí)，目前主要都是手動(dòng)固相萃取裝置。為了滿足快速、高效的檢測(cè)要求，本實(shí)驗(yàn)采用了全自動(dòng)固相萃取裝置，該設(shè)備能夠同時(shí)處理6 個(gè)樣品，能夠連續(xù)處理60 個(gè)以上樣品，特別是對(duì)于大體積上樣的水樣來(lái)說(shuō)極大地縮短了前處理時(shí)間。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的洗脫程序見表2，對(duì)于200 mL樣品，處理6個(gè)樣品只需要100 min。

2.1.3 洗脫液的確定

選擇洗脫液為純甲醇，對(duì)比4 mL、6 mL、10 mL洗脫液發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體積增加時(shí)對(duì)回收率的提高不明顯且會(huì)延長(zhǎng)氮吹的時(shí)間，太低又會(huì)影響洗脫效率，導(dǎo)致萃取柱有抗生素殘留，本實(shí)驗(yàn)確定了最佳的洗脫體積為6 mL。

2.1.4 pH值對(duì)固相萃取結(jié)果的影響

水樣的pH 值對(duì)最終的回收率影響較大，在酸性環(huán)境中回收率較高，那是因?yàn)棣?內(nèi)酰胺類抗生素在酸性環(huán)境中更加穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)比較了甲酸、EDTA-McIlvaine 緩沖溶液來(lái)調(diào)節(jié)水樣的pH 值，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)同樣的pH 值的情況下EDTA-McIlvaine 緩沖溶液的回收率更高?？赡苁且?yàn)樗械慕饘匐x子與緩沖液中的EDTA 產(chǎn)生了螯合反應(yīng)。最終優(yōu)化了pH值參數(shù)，確定了pH4時(shí)，回收率最佳。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相的分離效果，最后發(fā)現(xiàn)使用甲醇分離更好，質(zhì)譜信號(hào)更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)還比較了5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，加入甲酸銨峰形沒有明顯改善，且后兩種流動(dòng)相峰型差別不大，最后選擇了0.1%甲酸水-甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)6 種β-內(nèi)酰胺類抗生素的離子化方式、去簇電壓、碰撞電壓等進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表1。6種β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)譜圖見圖1—圖7。

2.3 目標(biāo)化合物的線性范圍、檢出限與定量限

6種β-內(nèi)酰胺類抗生素采用外標(biāo)法定量，配制6種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別是1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L，以各種抗生素的濃度為橫坐標(biāo)，以各種抗生素的峰面積為縱坐標(biāo)，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。按照S/N=3 計(jì)算各種抗生素的檢出限，按照S/N=10 計(jì)算各種抗生素的定量限，結(jié)果見表3。所有目標(biāo)化合物的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.997，該方法檢出限分別為0.0202～0.2679 μg/L；定量限分別為0.0672～0.8929 μg/L。

2.4 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

取生產(chǎn)用水添加5 μg/L 的6 種β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 組平行加標(biāo)樣品測(cè)定各抗生素的回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。6 種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為78.4%～93.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.31%～9.60%。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

根據(jù)以上建立的檢測(cè)方法對(duì)五糧液股份公司的生產(chǎn)用水中β-內(nèi)酰胺類抗生素含量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，濃縮200 倍后的生產(chǎn)用水中并未檢出上述6種抗生素。

表3 6種β-內(nèi)酰胺類抗生素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表4 6種β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)用水中加標(biāo)回收率和精密度(n=3)

3 結(jié)論

建立了全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)生產(chǎn)用水中6 種β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)方法，運(yùn)用該檢測(cè)法對(duì)五糧液釀酒車間的生產(chǎn)用水進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出。實(shí)驗(yàn)表明，該檢測(cè)法靈敏度高，穩(wěn)定性好，可以快速、高效的檢測(cè)水中的抗生素。本檢測(cè)法能夠?yàn)獒劸骗h(huán)境中抗生素的檢測(cè)提供參考。