劉 曉，劉廣瑞，隋 璐，胡錦榮，張京聲，劉 萍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.吉林省酒精研究院有限公司，吉林長(zhǎng)春 130022)

白酒作為我國(guó)傳統(tǒng)的蒸餾酒，是世界七大蒸餾酒之一，無論是生產(chǎn)技術(shù)還是產(chǎn)品風(fēng)格，都具有獨(dú)特的地位[1-2]?！扒司浦?，好曲出好酒”，濃香型大曲酒是我國(guó)主要白酒香型之一，以瀘州老窖為代表，酒體醇厚綿甜，香味協(xié)調(diào)，尾凈余長(zhǎng)，其主體香味是己酸乙酯與適量的乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯等構(gòu)成的復(fù)合香氣[3-4]。

白酒中各種揮發(fā)性成分的含量及其比例關(guān)系對(duì)白酒品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用，目前已在此方面有較多研究[5-7]。此外，對(duì)清香型[8]、醬香型[9]和濃香型[10-11]白酒酒醅中揮發(fā)性成分變化規(guī)律，也有相關(guān)研究報(bào)道。針對(duì)白酒和酒醅的分析研究，發(fā)酵方式都遵循傳統(tǒng)的純糧固態(tài)發(fā)酵方式，對(duì)于半固態(tài)法釀造濃香型白酒揮發(fā)性成分的研究，鮮有報(bào)道。馬茹菲等[12]以玉米為主要原料，并按比例添加高粱，探究半固態(tài)釀造清香型白酒的最優(yōu)工藝條件，但是并未對(duì)蒸餾酒中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。

目前，已有報(bào)道研究采用頂空-固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法測(cè)定酒醅中微量揮發(fā)性成分的分析[13-14]。GC-MS 法測(cè)定白酒中揮發(fā)性成分可以通過保留時(shí)間進(jìn)行定性，以及峰面積歸一法、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法等進(jìn)行定量分析，但是GC-MS對(duì)于微量成分的分析存在一定的局限性，容易受到雜質(zhì)干擾。固相微萃?。⊿PME）技術(shù)是新發(fā)展的一種樣品前處理方法，靈敏度高、檢出限低且可減少雜質(zhì)干擾；而頂空固相微萃?。℉SSPME）可以快速、便捷地萃取、吸附揮發(fā)性成分和半揮發(fā)性成分，結(jié)合GC-MS 準(zhǔn)確對(duì)微量成分進(jìn)行定性定量分析[15]。范文來等[16-17]應(yīng)用該技術(shù)測(cè)定固態(tài)濃香型酒醅以及大曲中的微量揮發(fā)性成分。張默雷等[18]對(duì)比研究HS-SPME 和液液萃取法兩種前處理方式對(duì)GC-MS 結(jié)果的影響，結(jié)果表明，HSSPME處理時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)種類更多、更全面。

前期研究結(jié)合固態(tài)釀造和液態(tài)釀造兩種發(fā)酵方式的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，分析得到最佳的半固態(tài)發(fā)酵工藝條件。本研究在最優(yōu)的工藝條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，采用HS-SPME 結(jié)合GC-MS 法對(duì)發(fā)酵18 d 酒醅中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究半固態(tài)法釀造濃香型白酒的發(fā)酵機(jī)理以及實(shí)際生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：脫胚玉米面（天津市寶坻區(qū)百立旭糧食加工廠）；高粱為北京市售；增香菌為安琪生香活性干酵母（安琪酵母有限公司）；濃香大曲粉（姜氏養(yǎng)生保健產(chǎn)品公司）。

標(biāo)物：白酒色譜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（內(nèi)標(biāo)/混標(biāo)），貴州計(jì)量研究院。

儀器設(shè)備：LRH-150 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TGC-16C 臺(tái)式離心機(jī)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；7890B-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）。65 μm PDMS/DVB萃取頭（美國(guó)Supelco公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

以玉米和高粱為原料釀造濃香型白酒的工藝條件為：濃香型大曲添加量為原料的30%、增香菌添加量為3.5%、料水比為1∶3.2、溫控條件為第1天28 ℃，第2 天33 ℃，第3 天30 ℃，4～18 d 為25 ℃、發(fā)酵時(shí)間為18 d。在該工藝條件下，以玉米為主要原料進(jìn)行半固態(tài)法釀造濃香型白酒。

將高粱粉碎至6～8 瓣，粉碎粒度為20 目篩上部分約占70 %；脫胚玉米面要求粒徑過20～40 目篩的比例約為30 %；過40～60 目篩的比例約20 %；過60 目篩部分約占50 %。按比例稱取玉米面和高粱碎（玉米∶高粱=7∶3），分別加入60%冷卻蒸餾水（以總干物料計(jì)，下同）混合均勻，進(jìn)行潤(rùn)料。高粱碎于室溫條件下潤(rùn)料12 h，上大汽蒸料4 h，而玉米面于室溫條件下潤(rùn)料0.5～3 h，大汽蒸料1 h，熟料揚(yáng)涼至室溫，備用。準(zhǔn)確稱取熟料200 g（玉米∶高粱=7∶3）于無菌容器中混合均勻，添加原料30 %的濃香型大曲、3.5 %增香菌、總料水比為1∶3.2、溫控條件為第1 天18 ℃、第2 天33 ℃、第3 天30 ℃、第4～18 天28 ℃，半固態(tài)發(fā)酵至18 d后，取酒醅進(jìn)行揮發(fā)性成分分析。主要的釀造工藝流程如圖1。

1.2.2 酒醅揮發(fā)性成分測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[19-20]作適當(dāng)修改，以最優(yōu)化的方法對(duì)酒醅樣品進(jìn)行前處理。方法如下：取酒醅樣品10000 r/min 離心8 min，吸取10 mL 上清液置于20 mL 頂空瓶中，加入2.0 g NaCl 和200 μL 內(nèi)標(biāo)乙酸正丁酯（乙酸正丁酯質(zhì)量濃度為17.94 mg/mL），于60 ℃水浴20 min。插入萃取頭，萃取40 min，萃取頭距離液面約1 cm。隨后，在GC進(jìn)樣口熱解吸5 min（250 ℃）進(jìn)行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱：（DB-WAX，30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度：230 ℃，程序升溫：40 ℃，保持3 min，5 ℃/min 升溫至150 ℃，保持5 min，再3 ℃/min 升至230 ℃，保持6 min，進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣（1.0 mL/min），載氣：氦氣（99.999%）[21]。

質(zhì)譜條件：接口溫度：230 ℃，離子源溫度：230 ℃，離子化方式：EI，電子能量：70 eV，掃描質(zhì)量范圍m/z：29～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分的分析檢測(cè)

當(dāng)酒醅樣品發(fā)酵至第18 天時(shí)，將酒醅樣品離心并取上清液進(jìn)行GC-MS 分析，酒醅中揮發(fā)性成分如表1所示。

采用固相微萃取法，對(duì)酒醅中揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取、吸附富集。GC-MS 測(cè)定時(shí)，利用各組分的保留時(shí)間不同，對(duì)比NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析，利用已知含量的內(nèi)標(biāo)乙酸正丁酯進(jìn)行定量分析以及峰面積歸一法計(jì)算各組分的相對(duì)百分比含量。由于DB-WAX 色譜柱填料主要成分為硅氧烷，剔除檢測(cè)結(jié)果中含有硅氧烷成分的物質(zhì)以及匹配因子小于70的物質(zhì)后，共檢測(cè)出48種揮發(fā)性物質(zhì)成分，其中酯類20種，醇類8種，酸類6種，酮類4種，芳香族5 種，其他5 種。酯類和醇類的相對(duì)含量較高，分別占總量的37.85%和39.23%，內(nèi)標(biāo)乙酸正丁酯占總揮發(fā)物質(zhì)14.92%，定量結(jié)果為351.80 mg/L。酯類物質(zhì)中棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯的相對(duì)含量較高，分別為7.83%、4.88%、3.92%、0.77%、0.72%、0.66%、0.64%。醇類物質(zhì)中乙醇、新戊二醇、丙三醇、異戊醇、(2R，3R)-(-)-2,3-丁二醇的相對(duì)含量較高，分別為23.06 %、4.78 %、4.58 %、3.28 %、1.99%。酸類物質(zhì)中己酸相對(duì)百分比為3.04%、含量為71.58 mg/L；乙酸相對(duì)百分比為2.53%、含量為59.64 mg/L。酮類物質(zhì)中3-羥基-2-丁酮的相對(duì)百分比為0.16%、含量為3.87 mg/L。芳香類物質(zhì)中苯乙醇相對(duì)百分比較高為4.81%，含量為113.49 mg/L。

2.2 酒醅中揮發(fā)性成分分類匯總（見表2）

白酒中揮發(fā)性物質(zhì)成分的量比關(guān)系是白酒質(zhì)量和風(fēng)格的關(guān)鍵因素，同一香型白酒的主體香氣成分應(yīng)保持一致。檢測(cè)結(jié)果表明，酯類和醇類的種類和含量均較高，且趨于平衡，該結(jié)果與已報(bào)道文獻(xiàn)相一致[5，22]。酯類的形成主要有兩種途徑：醇酸酯化和產(chǎn)酯酵母代謝產(chǎn)生。在發(fā)酵中后期的酯化階段和產(chǎn)酯酵母代謝階段控制合適的溫度，增強(qiáng)產(chǎn)酯能力。

己酸乙酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯作為濃香型白酒的特征香味成分，含量高低和量比關(guān)系決定著濃香型白酒質(zhì)量和風(fēng)格。己酸乙酯一般呈菠蘿香和水果香味，賦予酒體獨(dú)有的窖香，含量為15.16 mg/L；乳酸乙酯香氣稍弱、微甜，含量為17.01 mg/L；乙酸乙酯具有白酒香氣和甜香，含量為18.27 mg/L。研究報(bào)道認(rèn)為，乳酸乙酯含量和乙酸乙酯含量與己酸乙酯含量之比小于1 時(shí)，白酒的品質(zhì)較好，而本次工藝中“乳己比”為1.12，“乙己比”為1.21。目前我國(guó)白酒普遍存在乳酸乙酯含量過高的問題，實(shí)際生產(chǎn)時(shí)可控制酒窖理化指標(biāo)、改善微生物菌群等，從而提高白酒品質(zhì)[23-25]。癸酸乙酯似玫瑰香、蜂蜜香和梨香；亞油酸乙酯也可作為防治動(dòng)脈硬化、腦血栓等疾病的藥物原料，這為白酒提供保健功能理論基礎(chǔ)[19，22]。此外，辛酸乙酯含量較少，為6.72 mg/L，但已有研究報(bào)道通過GC-O 聞嗅技術(shù)，證實(shí)辛酸乙酯具有明確的水果香，對(duì)濃香型白酒復(fù)合香氣有促進(jìn)作用，且香氣強(qiáng)度值（OVA）較大，在酒體中有重要貢獻(xiàn)[26-27]。

醇類化合物具有令人愉快的香氣，乙醇含量最高，醇類總量為543.71 mg/L；2,3-丁二醇醇甜且有強(qiáng)烈的甜香、奶香和濃玫瑰花香，含量為46.86 mg/L；丙三醇味甜、有濃厚感，含量108.10 mg/L。酸類物質(zhì)是調(diào)節(jié)白酒口感的重要物質(zhì)，也是酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)。其中，乙酸具有強(qiáng)烈酸味，含量為59.64 mg/L；己酸呈奶酪臭味，含量為71.58 mg/L；而性質(zhì)特殊的乳酸、油酸等物質(zhì)沒有檢測(cè)到。苯乙醇在芳香物質(zhì)中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，含量為113.49 mg/L，呈蜜香玫瑰味。苯乙醇通常被認(rèn)為是米香型白酒的主體香味成分，但在清香型白酒和濃香型白酒中也有大量存在。3-羥基-2-丁酮有強(qiáng)烈奶油香氣、稀釋后呈現(xiàn)令人愉快的香味，其含量為3.87 mg/L。3-羥基-2-丁酮不是酮類中主要香氣成分，但是其還原后可生成醇甜的2,3-丁二醇。

表1 應(yīng)用HS-SPME-GC-MS法從酒醅中檢測(cè)出的揮發(fā)性成分

表2 酒醅中揮發(fā)性成分分類匯總

3 結(jié)論

本研究以玉米和高粱為釀酒原料，添加30 %濃香型大曲，3.5%增香菌，總料水比為1∶3.2，溫控條件為第1 天28 ℃、第2 天33 ℃、第3 天30 ℃、4～18 d 為25 ℃，發(fā)酵18 d。采用HS-SPME 結(jié)合GCMS 法對(duì)發(fā)酵18 d 的酒醅中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，共檢測(cè)到48種物質(zhì)，其中酯類20種、醇類8 種、酸類6 種、酮類4 種，芳香族5 種以及其他類5種。濃香型白酒特征性揮發(fā)性成分己酸乙酯含量為15.16 mg/L、乳酸乙酯含量為17.01 mg/L 以及乙酸乙酯含量為18.27 mg/L。本研究對(duì)于半固態(tài)釀造濃香型白酒的實(shí)際生產(chǎn)以及探索發(fā)酵周期短、酒體醇和、白酒品質(zhì)優(yōu)良的新型工藝提供一定的理論指導(dǎo)意義。