銀曉麗，王 君，王昕宇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801）

生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的葡萄酒需要澄清處理，目前常用的澄清劑如明膠、蛋清粉、單寧、膨潤(rùn)土等易與葡萄酒中的其他物質(zhì)相互作用，在澄清的同時(shí)殘留等問(wèn)題會(huì)影響葡萄酒的質(zhì)量。因此，安全穩(wěn)定的新型澄清劑的開(kāi)發(fā)和使用是葡萄酒生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題[1]。

殼聚糖是甲殼素在堿性條件下水解并脫去部分乙酰基后生成的衍生物[2]，是一種天然的高分子化合物。作為安全無(wú)毒的澄清劑，殼聚糖能和葡萄酒中帶負(fù)電荷的膠體相互作用，絮凝沉淀引起酒液渾濁的膠態(tài)顆粒,從而澄清酒體，產(chǎn)品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分基本不受影響,現(xiàn)已被美國(guó)食品藥物管理局批準(zhǔn)為食品添加劑[4-8]。不同分子量殼聚糖物化特性及功能差異很大,分子量到達(dá)一定程度時(shí)許多獨(dú)特功能才能表現(xiàn)出來(lái)[3]。本研究以殼聚糖為澄清劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不同條件下測(cè)定葡萄酒的透光率，確定殼聚糖最佳澄清工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

原酒：赤霞珠干紅葡萄酒（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院自釀）。

澄清劑：分子量7 kDa、100 kDa、250 kDa、700 kDa 的殼聚糖白色粉末，細(xì)度60 目，脫乙酰度≥85 %，使用時(shí)提前配制成1 %的溶液（山東濟(jì)南海得海貝海洋生物工程有限公司）。

儀器設(shè)備：UV-5100 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，BS210S 電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器場(chǎng))，HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)，HH-4 恒溫水浴箱(金壇市科析儀器公司)，LD4-2 型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品)，CM-5型色差儀(柯尼卡美能達(dá)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)法

1.2.1.1 不同分子量殼聚糖及其用量對(duì)澄清效果的影響

準(zhǔn)備20 支試管，分別加入葡萄酒原酒液各25 mL，將這些試管分為4 組，按梯度依次加入分子量7 kDa、100 kDa、250 kDa 和700 kDa 的殼聚糖各0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1 g/L，在實(shí)驗(yàn)室的室溫和自然的pH 條件下，將20 組試管避光靜置，6 h后取試管內(nèi)葡萄酒的上清液測(cè)定其透光率。

1.2.1.2 處理溫度對(duì)澄清效果的影響

準(zhǔn)備5 支試管，分別加入原酒液25 mL 和分子量7 kDa 的殼聚糖0.6 g/L，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃的不同溫度條件下一共分成5 組，避光靜置6 h 后取試管內(nèi)葡萄酒的上清液測(cè)定其透光率。

1.2.1.3 澄清時(shí)間對(duì)澄清效果的影響

準(zhǔn)備5 支試管，分別加入原酒液25 mL 和分子量7 kDa 的殼聚糖0.6 g/L，溫度30 ℃，時(shí)間分別為3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 的條件下分為5 組，避光靜置后取葡萄酒的上清液測(cè)定其透光率。

1.2.2 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)（表1）

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼

1.2.3 澄清度的測(cè)定方法

以試驗(yàn)室蒸餾水為葡萄酒透光率測(cè)定的空白對(duì)照,用1 cm 比色皿在分光光度計(jì)680 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定葡萄酒酒液的透光率,重復(fù)3 次。酒液的澄清度值用單位T表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量殼聚糖對(duì)葡萄酒澄清效果的影響

用不同分子量的殼聚糖對(duì)葡萄酒進(jìn)行澄清實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1 所示，選取分子量從7～700 kDA 的4 種殼聚糖，隨著殼聚糖用量的增加，葡萄酒的透光率先增大后減小。

分子量700 kDA 的殼聚糖添加0.4 g/L 時(shí)，透光率最高，其他分子量的殼聚糖添加0.6 g/L 時(shí)，透光率最高，用架橋機(jī)理[10]解釋：高分子殼聚糖通常要在低劑量條件下才會(huì)有良好的絮凝效果。

殼聚糖添加量超過(guò)0.6 g/L時(shí)，透光率均呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)檫^(guò)高濃度的殼聚糖會(huì)吸附在膠體顆粒的表面,形成的空間保護(hù)層會(huì)阻止形成橋架結(jié)構(gòu),絮凝不易發(fā)生[9]。殼聚糖的添加量有一個(gè)最佳值,若超過(guò)最佳值反而起穩(wěn)定保護(hù)作用[8]。

分子量7 kDa 的殼聚糖添加0.6 g/L 時(shí)，透光率為77.26%，此時(shí)澄清效果最佳。

2.2 處理溫度對(duì)澄清效果的影響

添加分子量7 kDa 的殼聚糖0.6 g/L 處理6 h，葡萄酒的透光率受不同處理溫度的影響如圖2，隨著溫度的上升，葡萄酒的透光率先上升后逐漸下降，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，透光率為78.74%，此時(shí)澄清效果最佳。

2.3 處理時(shí)間對(duì)葡萄酒澄清效果的影響

30 ℃條件下，添加分子量7 kDa的殼聚糖0.6 g/L，葡萄酒的透光率受不同處理時(shí)間的影響如圖3，葡萄酒的透光率隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)先明顯上升后逐漸下降，當(dāng)處理時(shí)間為6 h 時(shí)，透光率為82.34%，此時(shí)澄清效果最佳。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表2、表3）

用Design-Expert 10.0 軟件對(duì)表2 所列出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合處理，獲得葡萄酒透光率(Y)對(duì)殼聚糖添加量(A)、處理溫度(B)、處理時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為：

Y=84.74-3A-2.54B+0.6C-0.36AB+1.69AC-1.46BC-5.73A2-4.53B2-2.84C2

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3 可知，在響應(yīng)面方差分析中該模型的F值為29.30，概率p＜0.0001，表現(xiàn)為極顯著，說(shuō)明殼聚糖澄清紅葡萄酒的試驗(yàn)測(cè)定方法設(shè)計(jì)是極可靠的。失擬項(xiàng)的p＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M和性良好，試驗(yàn)產(chǎn)生的誤差較小。試驗(yàn)因素A、B 的p＜0.05，表現(xiàn)為極顯著，即殼聚糖用量、處理溫度對(duì)葡萄酒透光率的影響極顯著。試驗(yàn)因素C 的p＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明處理時(shí)間對(duì)酒體透光率的影響不顯著。交互項(xiàng)AB、BC 的p＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明殼聚糖用量與處理溫度、處理溫度與處理時(shí)間這兩組交互項(xiàng)均對(duì)葡萄酒透光率沒(méi)有顯著影響。交互項(xiàng)AC 的p＜0.05，表現(xiàn)為顯著，說(shuō)明殼聚糖用量和處理時(shí)間的交互作用對(duì)葡萄酒透光率的影響顯著。A2、B2、C2的p＜0.05，表現(xiàn)為顯著，說(shuō)明A2、B2、C2對(duì)葡萄酒透光率的變化影響顯著。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9635，說(shuō)明響應(yīng)值透光率的變化有96.35 %來(lái)源于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的所選變量，可以說(shuō)明該響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸方程擬合度和可信度非常高，采用且實(shí)施后試驗(yàn)誤差較小。根據(jù)以上的數(shù)據(jù)分析可得，以該回歸方程所示為澄清條件的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)際操作過(guò)程中干紅葡萄酒澄清效果的影響提供了一個(gè)效用良好的參考模型。

表3 響應(yīng)面方差分析

2.5 響應(yīng)面分析

交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可以通過(guò)等高線來(lái)反映，如果兩個(gè)因素間交互作用不顯著是圓形，顯著是橢圓形[11]。由圖4 可知，該等高線的形狀為明顯的橢圓，說(shuō)明殼聚糖用量與處理時(shí)間對(duì)葡萄酒透光率的交互效應(yīng)較顯著。葡萄酒的透光率隨著殼聚糖用量的增多與處理時(shí)間的延長(zhǎng)先逐漸上升又逐漸下降，且殼聚糖用量與處理溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響透光率，當(dāng)殼聚糖用量0.6 g/L、處理時(shí)間為6 h 時(shí)，透光率最高，此時(shí)的澄清效果最好。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)回歸模型的分析可知，殼聚糖用量0.55 g/L、處理溫度28.55 ℃、澄清時(shí)間6.22 h，此時(shí)葡萄酒透光率的預(yù)測(cè)值為85.4924 %，此時(shí)澄清效果最佳。進(jìn)一步選取殼聚糖添加量0.55 g/L、澄清處理溫度恒定為28 ℃、澄清處理時(shí)間固定為6.3 h進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)分光光度計(jì)的多次測(cè)定最終得出葡萄酒透光率的實(shí)際數(shù)值為85.40%。實(shí)際值與理論值相差不到0.09%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所篩選出的紅葡萄酒澄清工藝參數(shù)準(zhǔn)確性和可靠度高，得到的澄清工藝具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)考察不同的處理溫度、不同的處理時(shí)間、不同分子量的殼聚糖對(duì)葡萄酒澄清效果的研究，優(yōu)選出在30 ℃條件下，分子量為7 kDa 的殼聚糖0.6 g/L 處理6 h，葡萄酒的透光率可以達(dá)到86%以上，此時(shí)達(dá)到最佳澄清工藝條件。