邵彪　周小蘭　王琳琳　尤嘉　陳剛

摘 要：基于凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）凈化處理，建立輻照肉制品中2-十二烷基環(huán)丁酮（2-dodecylcyclobutanone，2-DCB）的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）檢測方法。樣品經(jīng)正己烷超聲提取、GPC凈化及氮吹濃縮等步驟處理后，利用GC-MS/MS多反應監(jiān)測模式進行分析。結果表明：2-DCB在質(zhì)量濃度10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=383 709.18x-4 686.41，相關系數(shù)為0.998 3;25、100、400 μg/kg 3 個加標水平的平均回收率為78.2%～105.5%，相對標準偏差小于7.3%;檢出限和定量限分別為1.8、6.0 μg/kg。該方法前處理操作簡單、可實現(xiàn)自動化批量處理，同時具有較高靈敏度。

關鍵詞：凝膠滲透色譜;輻照肉制品;氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;2-十二烷基環(huán)丁酮

Detection of 2-Dodecylcyclobutanone in Irradiated Meat Products by Gel Permeation Chromatography

Followed by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHAO Biao1， ZHOU Xiaolan2， WANG Linlin1， YOU Jia3， CHEN Gang1，*

（1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute， Nantong 226011， China; 2.Nantong University Analysis and Testing Center， Nantong 226019， China; 3.Nantong Food and Drug Supervision and Inspection Center， Nantong 226006， China）

Abstract： Based on clean-up by gel permeation chromatography （GPC）， a method for the determination of 2-dodecylcyclobutanone （2-DCB） in irradiated meat products by gas chromatography-tandem mass spectrometry

（GC-MS/MS） was established. Samples were subjected to sequential ultrasonic extraction with n-hexane， purification by GPC， concentration and nitrogen blowing evaporation to dryness before being analyzed by GC-MS/MS. The results showed that a linear calibration curve in the concentration range of 10–1 000 μg/L was obtained as follows y = 383 709.18x ? 4 686.41， with correlation coefficient of 0.998 3. The average recoveries of 2-DCB at three spiked concentration levels of 25， 100

and 400 μg/kg ranged from 78.2% to 105.5%， with relative standard deviation （RSD） lower than 7.3%. The detection limit and quantitation limit were 1.8 and 6.0 μg/kg， respectively. The method had the advantages of simple pretreatment， large-scale automated detection and high sensitivity.

Keywords： gel permeation chromatography; irradiated meat products; gas chromatography-tandem mass spectrometry; 2-dodecylcyclobutanone

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040

中圖分類號：O657.6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）04-0053-05

引文格式：

邵彪， 周小蘭， 王琳琳， 等. 凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測輻照肉制品中2-十二烷基環(huán)丁酮[J]. 肉類研究， 2020， 34（4）： 53-57. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

SHAO Biao， ZHOU Xiaolan， WANG Linlin， et al. Detection of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated meat products by gel permeation chromatography followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 53-57. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

食品輻照是以輻射技術為基礎，運用X射線、γ射線或高速電子束等電離輻射產(chǎn)生的高能射線對食品進行加工處理的一種殺菌及保藏技術，能夠起到殺蟲、殺菌、抑制生理過程的作用，實現(xiàn)提高食品衛(wèi)生質(zhì)量、延長貯藏期的效果[1-3]。輻照技術屬于冷加工技術，可以在常溫或低溫條件下進行，因此在食品加工領域具有巨大的應用價值[4-5]。然而，食品輻照過程中的能量傳遞會引發(fā)產(chǎn)生自由基以及一系列化學和生物效應，并伴隨物質(zhì)的降解和輻解副產(chǎn)物的生成[5-7]。因此，輻照食品存在一定的爭議，一方面來自于輻照處理產(chǎn)生的未知副產(chǎn)物，存在潛在安全隱患;另一方面，食品固有的營養(yǎng)成分，如維生素、蛋白質(zhì)等會遭到破壞或降解，降低其生理價值，影響食品品質(zhì)[8-9]。根據(jù)各國多年的研究結果，低劑量輻照對食品成分變化的影響非常細微，聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織/國際原子能機構組織的聯(lián)合專家委員會于1980年10月宣布，吸收劑量10 kGy以下的任何輻照食品都是安全的，無需作毒理學實驗[10]。多個國家依據(jù)10 kGy為劑量上限，為不同食品制定相應的輻照標準，允許輻照技術用于食品加工，但需要有輻射標識明示，并且不允許重復輻照。當前，輻照技術已廣泛應用于脫水蔬菜、香辛料、谷物、水果、花粉、大蒜、畜禽肉、水產(chǎn)品、速溶茶等食品中。但是，在輻照加工領域，為追求更好的食品衛(wèi)生質(zhì)量，存在超劑量輻照、重復輻照等違法輻照亂象，帶來一定的安全風險;同時，還有少部分輻照食品未按規(guī)定進行標識，侵害消費者知情權。因此，對于輻照食品，尤其是違法輻照食品的監(jiān)測和甄別具有重要意義。

輻照食品的鑒別方法有很多，如針對輻解化學產(chǎn)物的色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-14]、針對輻照產(chǎn)生自由基的電子自旋共振檢測法[15-16]、基于發(fā)光現(xiàn)象的熱釋光法、光致發(fā)光法和化學發(fā)光法[17-19]以及基于輻照引起DNA變化的DNA彗星法和熒光定量聚合酶鏈式反應法[20-21]等。對輻照肉制品而言，由于肉制品所含的脂肪酸經(jīng)輻照后能夠形成標志性輻解產(chǎn)物2-十二烷基環(huán)丁酮（2-dodecylcyclobutanone，2-DCB），因此被用于該類食品鑒別[22-23]。目前，2-DCB的分析方法包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定等[24-26]，

其中以GC-MS最為常用，現(xiàn)行的NY/T 2215—2012

《含脂輻照食品鑒定 氣相色譜質(zhì)譜分析 2-烷基環(huán)丁酮法》[27]和GB 21926—2016《食品安全國家標準 含脂類輻照食品鑒定 2-十二烷基環(huán)丁酮的氣相色譜-質(zhì)譜分析法》[28]

均采用該方法，前處理通過索氏抽提、硅膠層析柱凈化、氮吹濃縮等步驟進行提取凈化，過程較為繁瑣。

凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）是一種食品分析領域樣品前處理凈化的有效手段，其原理是根據(jù)分子質(zhì)量大小實現(xiàn)不同化合物的分離，能夠有效去除基質(zhì)中的脂肪、蛋白質(zhì)、色素、多糖等大分子成分[29]。GPC可以與定量濃縮裝置在線聯(lián)用，操作簡單便捷且可實現(xiàn)自動化處理，同時色譜柱能夠反復使用。

針對輻照肉制品中2-DCB的檢測，本研究嘗試以GPC進行凈化處理，并利用具有更高靈敏度的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）多反應監(jiān)測（multi reaction monitoring，MRM）模式進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉制品（調(diào)味豬肉、豬軟骨、雞肉）購于當?shù)厥袌?，輻照樣品委托南通市邁克爾輻照有限公司采用60Co γ射線處理。

2-DCB標準品（純度≥95%） 美國Sigma-Aldrich公司;正己烷（純度95%，色譜級）、環(huán)己烷（純度≥99.8%）、乙酸乙酯（純度≥99.8%，色譜級） 德國CNW公司;無水硫酸鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000D GC-MS/MS儀 美國Agilent公司;Freestyle樣品處理系統(tǒng)（含在線固相萃取/GPC/EVA定量濃縮裝置） 德國LC-Tech公司;Milli-Q超純水裝置 ? 美國Millipore公司;AL204/01電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;KQ 5200DE超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;0.22 μm有機微孔濾膜 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

將樣品粉碎，稱取約20 g（精確至0.000 1 g），加入100 mL正己烷，超聲提取30 min，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，加入10 g無水硫酸鈉靜置10 min，過濾后用正己烷重新定容至100 mL，獲得樣品提取液。

1.3.2 GPC處理

樣品提取液使用Freestyle樣品處理系統(tǒng)進行GPC純化。GPC條件：GPC色譜柱（32 cm×2.5 cm），填料為Bio-Beads SX3（200～400 目）;流動相：體積比1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯;流速5.0 mL/min;進樣量5.0 mL;紫外檢測波長254 nm;棄去前15 min流出液，收集16～46 min流分，淋洗3 min。

1.3.3 在線濃縮

所收集的流分通過EVA在線濃縮裝置分兩步濃縮，溫度參數(shù)：水加熱溫度40 ℃，錐底部溫度42 ℃;第1步濃縮至5 mL，用2 mL流動相清洗2 次，真空度16 kPa;第2步濃縮至3 mL，用1 mL流動相清洗2 次，真空度18 kPa;氮吹至近干，用正己烷定容至1 mL，即得樣品待測液。

1.3.4 GC-MS/MS測定條件

GC條件：HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;

載氣：He;流速1 mL/min;進樣口溫度260 ℃;升溫程序：100 ℃保持1 min;20 ℃/min升溫至160 ℃;2 ℃/min升溫至200 ℃;20 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min;進樣體積1 μL;分流方式：不分流。

MS/MS條件：電子轟擊離子源，離子源溫度230 ℃;一級MS四極桿溫度150 ℃，二級MS四極桿溫度150 ℃;電離能量70 eV;分辨率1.2 u;溶劑延遲時間6 min;傳輸線溫度280 ℃;碰撞氣（N2）流量1.5 mL/min;淬滅氣流量2.25 mL/min。

1.3.5 標準曲線、檢出限及定量限測定

以正己烷為溶劑，將2-DCB配制成質(zhì)量濃度2 mg/L

的標準溶液，并稀釋成10、25、50、100、500、1 000 μg/L系列標準工作液，利用所確定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)進行分析，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，對應的定量離子對峰面積為縱坐標，得出標準工作曲線方程。取不含2-DCB的基質(zhì)樣品，加入2-DCB標準溶液（添加量10 μg/kg），按照所建立的方法重復測定10 次，以結果標準偏差的3 倍計算方法檢出限，以結果標準偏差的10 倍計算定量限。

1.3.6 回收率與精密度測定

在未經(jīng)輻照肉制品（調(diào)味豬肉、豬軟骨、雞肉）中分別添加25、100、400 μg/kg 3 個水平的2-DCB標準溶液，利用所建立的方法進行分析，平行測定6 次，計算回收率與相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 結果計算

樣品中2-DCB含量按下式計算。

式中：ρ、ρ0分別為根據(jù)標準曲線方程求得的樣品待測液及未經(jīng)輻照的空白對照樣品中2-DCB質(zhì)量濃度/（μg/L）;m為樣品質(zhì)量/g。

2 結果與分析

2.1 樣品提取與凈化處理

根據(jù)2-DCB的脂溶性特征，同時參照NY/T 2215—2012

和GB 21926—2016，選擇正己烷作為提取溶劑。肉制品基質(zhì)復雜，樣品提取過程不可避免帶來蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，不僅會對后續(xù)分析檢測結果造成干擾，還會帶來污染，影響儀器使用。2-DCB相對分子質(zhì)量為238，采用GPC凈化處理以去除肉制品基質(zhì)中脂肪、蛋白質(zhì)等大分子成分。結果表明，在本研究參數(shù)條件下，前16 min內(nèi)大分子物質(zhì)能夠被有效去除，40 min內(nèi)化合物被全部洗脫。為提高回收率同時避免不同樣品基質(zhì)帶來的不確定性，在16～46 min收集色譜流分。此外，由于GPC凈化對樣品具有稀釋效應，使用在線定量濃縮裝置對凈化后樣品進行濃縮。

2.2 色譜條件與質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

根據(jù)2-DCB的極性，選用弱極性的HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進行分析，在確定的色譜分析條件下，利用全掃描模式獲得一級質(zhì)譜圖。

由圖1可知，一級質(zhì)譜圖中豐度較高的離子為m/z 98.1、

m/z 112.2，分別以其作為母離子，通過設定不同碰撞電壓進行碰撞，比較所獲得離子對的豐度大小。選擇豐度較高的4 對離子對作為MRM離子對進行監(jiān)測。經(jīng)過優(yōu)化，確定2-DCB的MRM參數(shù)如表1所示。以豐度最高的離子對m/z 98.1>83.1作為定量離子對，其余離子對作為定性離子對。

2.3 標準曲線、檢出限和定量限

利用GC-MS/MS的MRM模式分析2-DCB標準溶液，所得總離子流圖和定量離子流圖如圖2所示。所得標準曲線方程為y=383 709.18x-4 686.41，相關系數(shù)為0.998 3，方法檢出限和定量限分別為1.8、6.0 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

由表2可知，樣品平均加標回收率為78.2%～105.5%，RSD為1.3%～7.3%，表明該方法準確度和精密度較高，能夠較好地測定肉制品中2-DCB含量。

2.5 樣品測定

利用本研究所建立的方法分析0、10、20 kGy輻照劑量下調(diào)味豬肉、豬軟骨、雞肉中2-DCB的含量，通過比較目標色譜峰與標準物質(zhì)的保留時間及相應子離子豐度比進行定性，通過標準曲線方程計算2-DCB含量，20 kGy輻照劑量下樣品離子流圖如圖3所示。

A～C. 分別為調(diào)味豬肉、豬軟骨和雞肉;

下標1～2. 分別為總離子流圖和定量離子流圖。

由表3可知，未經(jīng)輻照樣品中2-DCB均未檢出，印證了其可作為含脂類輻照食品鑒別的化學標志物。對于同一樣品，2-DCB含量與輻照劑量具有相關性，輻照劑量越大，2-DCB含量越高，因此，2-DCB含量可以用作超劑量輻照的判別依據(jù)。

3 結 論

采用GPC對樣品進行凈化處理，利用GC-MS/MS的MRM模式，建立輻照肉制品中2-DCB檢測方法?；|(zhì)樣品加標回收實驗和精密度實驗結果證實了方法的可行性和準確性。本方法在前處理過程中，利用GPC與定量濃縮裝置在線聯(lián)用，實現(xiàn)自動批量處理，避免了現(xiàn)行標準中復雜的操作過程;在分析步驟中，采用GC-MS/MS的MRM模式進行分析，相較于GC-MS法具有較高靈敏度，同時，篩選出多對離子對進行監(jiān)測，有利于更加準確地定性，避免假陽性結果。

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收稿日期：2020-02-20

基金項目：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2015QK060）;

江蘇省質(zhì)量技術監(jiān)督“352專業(yè)技術人才培養(yǎng)工程”資助項目;南通市“226高層次人才培養(yǎng)工程”資助項目

第一作者簡介：邵彪（1983—）（ORCID： 0000-0001-8749-889X），男，高級工程師，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全分析。

E-mail： shaobiao1983@sina.com

通信作者簡介：陳剛（1967—）（ORCID： 0000-0002-1817-205X），男，教授級高級工程師，碩士，研究方向為食品質(zhì)量與安全分析。E-mail： 1351292318@qq.com