李燦，方茜，魏春海，曾蘊(yùn)儀，黃定武，古航坤

(廣州大學(xué) 土木工程學(xué)院 市政工程系,廣東 廣州 510006)

我國(guó)是世界上花生產(chǎn)量最大的國(guó)家,年產(chǎn)量約1 331.4萬(wàn)t[1],其中用來(lái)榨油比例達(dá)到60%[2]。每年榨油剩余的花生粕約有900多萬(wàn)t,蛋白含量高達(dá)40%～50%[3],但花生粕多作為飼料被廉價(jià)出售,極大地浪費(fèi)了蛋白質(zhì)和纖維素資源[4]。果蔬皮含有一定的營(yíng)養(yǎng)和功能性成分[5],比如果膠、多糖等,可以用于吸附污水中的重金屬[6]。研究表明，果蔬皮的厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的潛力比農(nóng)作物秸稈更高[7],同時(shí)厭氧降解的中間產(chǎn)物也是很好的能源物質(zhì),如氫氣、揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)等,其中VFAs在作為原料轉(zhuǎn)化為生物氣體、合成微生物表面活性劑和絮凝劑[8-9]、以及生物產(chǎn)電[10-12]等均有應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

果蔬皮取自于廣州大學(xué)城某水果蔬菜批發(fā)市場(chǎng),自然晾曬48 h,再經(jīng)攪拌機(jī)攪拌,過(guò)篩(篩孔直徑為0.9 mm),放入冰箱保存；花生粕取自廣州某榨油廠,其外觀呈現(xiàn)大小不一的黃褐色片狀固體,用攪拌機(jī)攪拌成粉末狀,經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾,用干燥皿進(jìn)行保存；接種污泥，取自廣州某污水廠的水解酸化池,污泥濃度(MLVSS)4 300 mg/L。

SHZ-C水浴恒溫振蕩器；島津GC7900氣相色譜儀；2501PC紫外分光光度計(jì)；Liqui TOCⅡ總有機(jī)碳分析儀；EA2400Ⅱ總氮(TN)元素分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 用3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)器內(nèi)pH=12,在120 r/min的條件下?lián)u瓶振蕩12 h,靜置12 h,使花生粕和果蔬皮中有機(jī)物充分溶解釋放至液相[13]，用3 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=7后待用。

1.2.2 厭氧發(fā)酵 厭氧發(fā)酵裝置見(jiàn)圖1。

圖1 厭氧發(fā)酵試驗(yàn)裝置圖Fig.1 Schematic diagram of anaerobic fermentation experimental device1.取樣口；2.橡膠塞；3.錐形瓶；4.遮光塑料膜；5.密封夾；6.水浴恒溫振蕩器

各反應(yīng)器均接種污泥200 mL,進(jìn)行氮?dú)獯得?除去反應(yīng)器溶液上部的氧氣,保證反應(yīng)器嚴(yán)格的厭氧環(huán)境。發(fā)酵的條件采用中溫消化(35 ℃)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,每隔1～2 d提取反應(yīng)器中混合液,經(jīng)離心(4 000 r/min,10 min)、過(guò)濾(0.45 μm)后進(jìn)行化學(xué)需氧量(COD)、VFAs、蛋白質(zhì)、多糖、氨氮等指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 分析方法

1.3.1 水質(zhì)分析方法 各水質(zhì)指標(biāo)均采用標(biāo)準(zhǔn)分析方法[13],COD利用重鉻酸鉀氧化-硫酸亞鐵銨滴定法,氨氮采用納氏分光光度法[14],多糖采用苯酚-硫酸法[15],蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[16],TOC和TN采用元素分析儀測(cè)定。

1.3.2 VFAs檢測(cè) VFAs(包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸)用氣相色譜儀檢測(cè)[17],采用FID檢測(cè)器,色譜柱為CNW CD-WAX毛細(xì)柱。樣品在1 000 r/min的條件下離心10 min,經(jīng)0.45 μm的膜過(guò)濾,用甲酸進(jìn)行酸化處理,進(jìn)樣每次為1 μL,載氣為氮?dú)?柱溫采用程序升溫,初始溫度為80 ℃,以20 ℃/min升至110 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min升至180 ℃,保持1 min,檢測(cè)器和進(jìn)樣口溫度分別為250 ℃和220 ℃,采集時(shí)間12 min。檢測(cè)之前,先要建立VFAs標(biāo)線(xiàn),乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸的出峰時(shí)間分別為4.3,5.3,5.7,6.4,6.9,7.8 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同C/N條件下的VFAs產(chǎn)量

共運(yùn)行5個(gè)反應(yīng)器,通過(guò)花生粕和果蔬皮的投加量來(lái)控制反應(yīng)器內(nèi)的初始的碳氮比。原材料性質(zhì)見(jiàn)表1，各反應(yīng)器的碳氮比見(jiàn)表2，各反應(yīng)器中VFAs總產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化見(jiàn)圖2。

表1 原材料的性質(zhì)Table 1 Properties of experimental raw material

表2 試驗(yàn)方案原料配比Table 2 Raw material proportion for experiment

圖2 不同C/N的情況下總VFAs隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.2 Changes of total VFAs with fermentation time under different C/N conditions

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)的前3 d產(chǎn)酸量均比較低,大致的趨勢(shì)也相同,從第3 d開(kāi)始4#器(52∶1)的產(chǎn)酸量開(kāi)始上升,趨勢(shì)明顯好于其他幾個(gè)反應(yīng)器,從第6 d 始,各個(gè)反應(yīng)器的產(chǎn)酸量都有一個(gè)較大的上升,都在第16 d達(dá)到了最大值。總產(chǎn)酸量,3#反應(yīng)器(37∶1)>5#反應(yīng)器(花生粕空白) >4#反應(yīng)器(52∶1)>2#反應(yīng)器(31∶1) >1#反應(yīng)器(15∶1)。

對(duì)所有反應(yīng)器來(lái)說(shuō),VFAs各組分中均是乙酸占比最大,顯示乙酸型發(fā)酵占主導(dǎo)地位。不同C/N條件下VFAs中的乙酸占比見(jiàn)圖3。

由圖3可知，花生粕空白組和C/N為37和52的花生粕與果蔬皮混合組,其穩(wěn)定乙酸占比均在80%以上。而C/N為15和31的花生粕與果蔬皮混合組,其乙酸占比出現(xiàn)了隨時(shí)間先增大后下降的現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)后期的乙酸占比在60%左右,而異戊酸占比略有上升。

圖3 不同C/N條件下VFAs中的乙酸占比Fig.3 Acetic acid proportion in VFAs under different C/N condition

2.2 不同C/N條件下的VFAs轉(zhuǎn)化率

因各反應(yīng)器中投加底物的配比不同,有機(jī)質(zhì)總量也不相同,所以把所產(chǎn)VFAs的當(dāng)量總有機(jī)碳(TOC)(或當(dāng)量化學(xué)需氧量(COD))與原底物中的TOC(或COD)的比值定義為有機(jī)底物的VFAs轉(zhuǎn)化率,以更好地比較各反應(yīng)器的產(chǎn)酸效能。由各種VFAs的分子式可知，乙酸(C2H4O2)、丙酸(C3H6O2)、丁酸(C4H8O2)、戊酸(C5H10O2)的含碳量分別為0.4,0.486,0.545,0.588 2 g/g。根據(jù)各種VFAs的產(chǎn)量即可計(jì)算出其當(dāng)量TOC,而原底物中各物質(zhì)的TOC的含量已知,因此可以計(jì)算出基于當(dāng)量TOC的VFAs轉(zhuǎn)化率。

在反應(yīng)進(jìn)行的前段時(shí)間,各反應(yīng)器的VFAs當(dāng)量TOC與底物TOC的比值均很低,產(chǎn)酸菌的數(shù)量以及對(duì)有機(jī)物的利用效率都跟不上有機(jī)物的水解效率,隨著反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)酸量開(kāi)始累積,反應(yīng)條件更適合產(chǎn)酸菌的生存,酸性條件可以使有機(jī)物的結(jié)構(gòu)松散,同時(shí)可以促使大分子的有機(jī)物水解成小分子的溶解性有機(jī)物[18],產(chǎn)酸的能力開(kāi)始上升,從第4 d開(kāi)始,4#反應(yīng)器(52∶1)和3#反應(yīng)器(37∶1)的VFAs當(dāng)量TOC與底物TOC的比值開(kāi)始上升,到15 d，3#反應(yīng)器(37∶1)達(dá)到頂峰85%,3#反應(yīng)器(37∶1)>4#反應(yīng)器(52∶1)>5#反應(yīng)器(花生粕空白)>2#反應(yīng)器(31∶1)>1#反應(yīng)器(15∶1),C/N為31∶1和15∶1的VFAs當(dāng)量TOC與底物TOC的比值均較花生粕空白組要小,因?yàn)榛ㄉ傻牡鞍踪|(zhì)含量較高,因此其水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的氨氮含量也較高,高的氨氮含量會(huì)抑制產(chǎn)甲烷的反應(yīng),與VFAs相結(jié)合，有助于產(chǎn)酸的緩沖體系的形成,更易于VFAs的積累,在反應(yīng)進(jìn)行的后段,VFAs當(dāng)量TOC與底物TOC的比值都會(huì)降低，可能是因?yàn)楫a(chǎn)甲烷菌開(kāi)始發(fā)揮作用，導(dǎo)致反應(yīng)從產(chǎn)酸階段進(jìn)行到厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷階段,VFAs被利用，因此導(dǎo)致比值降低。

同樣地,由各種VFAs的氧化方程式(1)～(4)可知，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的當(dāng)量COD轉(zhuǎn)化系數(shù)分別為1.07，1.51，1.82，2.04 g/g,進(jìn)而可以計(jì)算出其當(dāng)量COD,而原底物中COD近似于反應(yīng)器中初始COD(假定預(yù)處理后固體有機(jī)物均已轉(zhuǎn)化為溶解態(tài)),因此可計(jì)算出基于當(dāng)量COD的VFAs轉(zhuǎn)化率。

(1)

(2)

(3)

(4)

經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn),VFAs當(dāng)量TOC/底物TOC,與VFAs當(dāng)量COD/底物COD的趨勢(shì)大致相同,因此用VFAs當(dāng)量TOC與底物TOC的比值是衡量VFAs轉(zhuǎn)化率的適宜指標(biāo)。

圖4 不同C/N情況下VFAs當(dāng)量TOC/底物TOC的變化Fig.4 Variation of VFAs equivalent TOC/substrate TOC under different C/N conditions

圖5 不同C/N的情況下VFAs當(dāng)量COD/底物COD隨時(shí)間的變化Fig.5 Variation of VFAs equivalent COD/substrate COD with time under different C/N conditions

2.3 不同C/N下花生粕和果蔬皮聯(lián)合厭氧發(fā)酵中多糖和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化

2.3.1 多糖含量的變化 碳水化合物是微生物厭氧降解產(chǎn)酸的較好原材料,因此多糖的降解速率能夠較好地反應(yīng)微生物產(chǎn)酸的能力。由圖6可知，多糖的含量一直是呈下降的趨勢(shì),最后趨于穩(wěn)定。多糖在前期的下降趨勢(shì)明顯，說(shuō)明微生物優(yōu)先利用多糖,在反應(yīng)前8 d各反應(yīng)器的多糖含量下降均十分明顯,之后的含量變化不大,其中2#反應(yīng)器(31∶1),3#反應(yīng)器(37∶1),4#反應(yīng)器(52∶1)的多糖在前2 d的下降速率達(dá)到最大值，分別為K2#=331.6 mg/d,K3#=573.32 mg/d,K4#=259.7 mg/d?；ㄉ煽瞻捉M和1#(15∶1)在2～4 d的下降速率達(dá)到最大值,K1#=338.3 mg/d,K5#=466.65 mg/d,K3#>K5#>K1#>K2#>K4#?？瞻捉M和1#反應(yīng)器(15∶1)由于底物主要是花生粕,因此多糖的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)也基本一致,體現(xiàn)為前6 d近似直線(xiàn)快速下降,后期基本穩(wěn)定,呈現(xiàn)顯著的兩階段,而2#、3#、4#反應(yīng)器的底物主要由花生粕和果蔬皮共同貢獻(xiàn),因此這三組的多糖的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)也大致相同,前4 d快速線(xiàn)性下降,中間到10 d左右緩慢下降,后期基本穩(wěn)定,呈現(xiàn)顯著的三階段。由上可知，發(fā)酵的前期微生物優(yōu)先利用多糖。

圖6 不同C/N的情況下多糖含量的變化Fig.6 Changes in polysaccharides content under different C/N conditions

2.3.2 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化 反應(yīng)開(kāi)始前，各反應(yīng)器中蛋白質(zhì)的含量分別為：1#反應(yīng)器(15∶1)1 817.76 mg,2#反應(yīng)器(31∶1)1 820.19 mg,3#反應(yīng)器(37∶1)2 063.54 mg,4#反應(yīng)器(52∶1)1 300.65 mg,5#反應(yīng)器(花生粕空白)2 316.24 mg。反應(yīng)開(kāi)始前4 d,蛋白質(zhì)的含量都有一定的上升,主要原因是在細(xì)菌胞外酶的作用下使得花生粕和果蔬皮中的固體蛋白質(zhì)水解轉(zhuǎn)化為溶解態(tài)蛋白質(zhì)所致。之后，產(chǎn)酸細(xì)菌開(kāi)始利用蛋白質(zhì),對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化,4#反應(yīng)器(52∶1)由于C/N值最大,蛋白質(zhì)含量較低,碳水化合物含量高,反應(yīng)中主要是以利用多糖為主,因此蛋白質(zhì)含量的變化幅度不大,在反應(yīng)的第9～16 d蛋白質(zhì)含量降低速度較快,說(shuō)明產(chǎn)酸菌已充分利用多糖,并開(kāi)始利用蛋白質(zhì)來(lái)產(chǎn)酸,由此可見(jiàn)蛋白質(zhì)降解速率與產(chǎn)酸效率密切相關(guān),蛋白質(zhì)的降解速率越快,產(chǎn)酸的速度也越快。

產(chǎn)酸菌優(yōu)先以多糖為底物(前4～5 d),當(dāng)多糖被大部分降解轉(zhuǎn)化之后才開(kāi)始利用蛋白質(zhì)。這與厭氧微生物普遍對(duì)氮磷的需求較碳源較低有關(guān)。實(shí)驗(yàn)整體上存在先降解多糖、再降解多糖和蛋白質(zhì)、最后降解蛋白質(zhì)三個(gè)階段。

圖7 不同C/N情況下蛋白質(zhì)的含量的變化Fig.7 Changes in protein content under different C/N conditions

2.4 不同C/N下氨氮在發(fā)酵過(guò)程中的變化

氨氮含量的變化見(jiàn)圖8。

圖8 不同C/N情況下氨氮含量的變化Fig.8 Changes of ammonia nitrogen content under different C/N conditions

由圖8可知，發(fā)酵過(guò)程中基本每個(gè)反應(yīng)器中的氨氮含量都會(huì)有所上升,主要是因?yàn)榘钡堑鞍踪|(zhì)水解酸化的產(chǎn)物,隨著后期蛋白質(zhì)被產(chǎn)酸菌分解利用,氨氮含量隨之升高。其中5#反應(yīng)器(花生粕空白)的氨氮含量最高,因?yàn)樵摻M的蛋白質(zhì)含量最高,沒(méi)有果蔬皮的添加,多糖含量較少,主要以蛋白質(zhì)的水解酸化為主。同時(shí)1#反應(yīng)器(15∶1)、2#反應(yīng)器(31∶1)、3#反應(yīng)器(37∶1)都是在11～16 d氨氮的上升速度加快最后達(dá)到峰值,與VFAs總量的上升曲線(xiàn)相符,VFAs恰好也是在這一階段達(dá)到最大值,也能夠印證氨氮和VFAs是呈正相關(guān)的關(guān)系。4#反應(yīng)器因花生粕投量低，蛋白質(zhì)低,致使氨氮含量也最低,且與蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)一致 。

2.5 不同C/N下各因素對(duì)VFAs產(chǎn)量的影響相關(guān)性分析

為了研究多糖、蛋白質(zhì)和氨氮等因素對(duì)VFAs產(chǎn)量的影響,采用皮爾遜(pearson)相關(guān)性分析。皮爾遜相關(guān)性分析主要針對(duì)的是連續(xù)并且呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)系列,經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)驗(yàn)證，本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,滿(mǎn)足分析要求。根據(jù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)法,當(dāng)∣r∣≤1,且r>0時(shí)表示兩個(gè)變量正相關(guān),相反，則表示負(fù)相關(guān)。

(5)

根據(jù)上式，對(duì)各反應(yīng)器的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,用SPSS21.0軟件分析VFAs產(chǎn)量與多糖、蛋白質(zhì)以及氨氮含量的皮爾遜相關(guān)性,同時(shí)也分析了多糖、蛋白質(zhì)、氨氮三者之間的相關(guān)性,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各反應(yīng)器中各影響因子的皮爾遜系數(shù)Table 3 Pearson coefficients of influencing factors in each reactor

注：**表示極顯著相關(guān),*表示顯著相關(guān)。

由表3可知,1#反應(yīng)器(15∶1),VFAs產(chǎn)量與多糖含量呈負(fù)相關(guān),多糖含量降低，促使VFAs產(chǎn)量升高。VFAs與蛋白質(zhì)同樣呈負(fù)相關(guān),原因是蛋白質(zhì)水解酸化是VFAs的重要來(lái)源,VFAs產(chǎn)量與氨氮沒(méi)有顯著的關(guān)系,多糖與氨氮呈負(fù)相關(guān),由于產(chǎn)酸菌利用有機(jī)物有一定的順序,當(dāng)多糖降低時(shí),就開(kāi)始利用蛋白質(zhì)水解,蛋白質(zhì)水解促使氨氮含量上升。2#反應(yīng)器(31∶1)VFAs產(chǎn)量與蛋白質(zhì)和多糖沒(méi)有顯著關(guān)系。3#反應(yīng)器(37∶1)VFAs和多糖呈顯著負(fù)相關(guān),VFAs與蛋白質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān),VFAs與氨氮呈顯著正相關(guān),原因是蛋白質(zhì)的水解促進(jìn)VFAs的產(chǎn)量，同時(shí)氨氮也是蛋白質(zhì)水解的產(chǎn)物,因此二者是一個(gè)同升的趨勢(shì)。4#反應(yīng)器(52∶1)VFAs與多糖呈顯著負(fù)相關(guān),多糖和氨氮呈顯著正相關(guān),但VFAs與蛋白質(zhì)沒(méi)有顯著的相關(guān)性,原因可能是這一組的C/N比較高,VFAs產(chǎn)量以多糖水解為主要渠道,蛋白質(zhì)水解對(duì)VFAs產(chǎn)量的貢獻(xiàn)不大,因此相關(guān)性較弱。5#反應(yīng)器(花生粕空白)VFAs和蛋白質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān),與多糖沒(méi)有明顯的相關(guān)性。

3 結(jié)論

(1)花生粕和果蔬皮聯(lián)合發(fā)酵VFAs轉(zhuǎn)化效率最好的C/N在37∶1左右,以VFAs當(dāng)量TOC/底物TOC計(jì)，達(dá)到90%以上，以VFAs當(dāng)量COD/底物COD計(jì)，達(dá)到80%以上。兩者表現(xiàn)出良好的一致性。

(2)發(fā)酵過(guò)程中VFAs和多糖呈顯著負(fù)相關(guān)、與蛋白質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)、與氨氮呈顯著正相關(guān)。蛋白質(zhì)和多糖是影響VFAs產(chǎn)量的最主要的兩個(gè)影響因素。