于明秀，呂文學(xué)，署文杰，孫西慶

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

偏頭痛是一種反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)功能障礙性疾病，主要表現(xiàn)為一側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)性的劇烈頭痛，有發(fā)作性、搏動(dòng)性的特點(diǎn)，發(fā)作時(shí)生活和工作能力下降，嚴(yán)重危害患者身心健康。中醫(yī)藥治療偏頭痛已有幾千年歷史，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。經(jīng)多年的臨床實(shí)踐，孫西慶教授用頭風(fēng)湯治療偏頭痛臨床療效顯著[1]，頭風(fēng)湯由加味二陳湯加減創(chuàng)制而成，具有清熱燥濕之功效。本課題研究中，將頭風(fēng)湯做顆粒制劑，復(fù)制了偏頭痛大鼠模型，研究頭風(fēng)顆粒對偏頭痛大鼠腦膜組織及中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)c-fos、c-jun mRNA表達(dá)的影響，探究偏頭痛發(fā)病機(jī)制，探討頭風(fēng)顆粒預(yù)防和治療偏頭痛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠120只，雌雄各半，體重200～250 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001，合格證號0055920。

1.1.2 主要藥劑與儀器 頭風(fēng)顆粒(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部提供中藥材，制劑室加工制為散劑)；硝酸甘油注射液(5 mg/mL，北京益民藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 H11020289，產(chǎn)品批號20160906)；10%水合氯醛溶液(魯藥準(zhǔn)字 H01080291，產(chǎn)品批號：20161201)；0.9%氯化鈉注射液(500 mL：4.5 g，華仁藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 H37021260，產(chǎn)品批號160806H2)；PBS緩沖液(0.01 M，pH=7.2～7.4，山東省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)中心配制)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SyBRGreen qPCR Master Mix試劑盒(invitrogen生物技術(shù)公司)，引物為上海生工合成；兔抗大鼠c-fos、c-jun抗體購自abcom公司；DAB顯色試劑盒劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材 腦立體定位儀(深圳瑞沃德(Reward)公司)；大鼠冠狀面腦模具(深圳瑞沃德(Reward)公司)；全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國Lica公司，Asp300型)；石蠟組織包埋機(jī)，(德國Lica公司，EG1160型)；恒冷箱切片機(jī)(德國Lica公司，CM1850型)；超低溫冰箱(日本三洋公司)；光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)；超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司)；微量加樣槍(德國Eppendorf公司)；低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Milipore超純水機(jī)(法國Milipore公司)；Roche LightCycler 480II PCR儀(德國羅氏公司)；Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo公司)；Leica DM480圖像分析系等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、給藥 120只SD大鼠在相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、頭風(fēng)顆粒治療組和頭風(fēng)顆粒預(yù)防組，每組各30只。給予模型組、頭風(fēng)顆粒治療組和頭風(fēng)顆粒預(yù)防組大鼠造模，建立實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物模型，方法為皮下注射硝酸甘油注射劑，劑量按體重10 mg/kg；正常對照組皮下注射等量的生理鹽水。造模30 min后，給予模型組大鼠灌胃蒸餾水，劑量按體重1.04 mL/kg；給予頭風(fēng)顆粒治療組大鼠灌胃頭風(fēng)顆粒，劑量按體重1.04 mg/kg；在建立模型前給予頭風(fēng)顆粒預(yù)防組大鼠灌胃頭風(fēng)顆粒1周，劑量按體重1.04 mg/kg。

1.2.2 模型制備 大鼠稱重，以10 mg/kg計(jì)算GTN用量，皮下注射GTN誘發(fā)偏頭痛模型，造模成功判定：造模后5～10 min，大鼠即出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增多、前肢頻繁撓頭、煩躁不安等現(xiàn)象，約30～60 min達(dá)高峰，持續(xù)約3 h后，大鼠呈現(xiàn)活動(dòng)減少、蜷臥狀態(tài)。

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism5軟件統(tǒng)計(jì)分析并作圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組之間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在構(gòu)建學(xué)習(xí)共同體時(shí)，應(yīng)該遵循“組內(nèi)異質(zhì)，組間同質(zhì)”的原則，以學(xué)習(xí)者特征分析數(shù)據(jù)為依據(jù)，以促進(jìn)溝通交流為目的，從而為課堂活動(dòng)的順利展開打下基礎(chǔ)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Rt-PCR) ①解剖學(xué)定位取材：取材過程中為保證每只動(dòng)物的取材位置在PAG的相同位置，應(yīng)用了腦模具和前囟標(biāo)記的方法，以此保證取材盡可能是在相同位點(diǎn)。快速取出大鼠中腦PAG。(備注：3只動(dòng)物的PAG作為一個(gè)樣品)。②總RNA提?。翰捎肨RIzol法提取各組總RNA，抽取獲得的RNA經(jīng)鑒定及定量分析后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5min。取2ulcDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：變性 95 ℃ 10s、退火60 ℃ 30s、延伸72 ℃ 10s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Rt-PCR)檢測PAG中c-fos和c-jun mRNA的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。c-fos上游引物為5′-GAGGGAGCTGACAGATACGC-3′，下游引物為5′-CTCGGGGTAGGTGAAGACAAA-3′；c-jun的上游引物為5′-CGTTCCTCCAGTCCGAGA-3′，下游引物為5′-AAGTTGCTGAGGTTGGCG-3′；β-actin上游引物為5′-CCACACCCGCCACCAGTTC-3′，下游引物為5′-TACAGCCCGGGGAGCATCGT-3′。③實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化：在qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束之后，得到各個(gè)標(biāo)本組織的表達(dá)Ct值，Ct值為反應(yīng)實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，擴(kuò)增呈現(xiàn)對數(shù)增長，與組織標(biāo)本的起始拷貝數(shù)呈現(xiàn)反比。樣本△Ct=待測基因Ct的平均值-參照基因Ct的平均值。采用2(-△△Ct)法計(jì)算得出相對表達(dá)量。

1.2.4 腦膜組織形態(tài)觀察 將腦膜從顱骨上分離，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組腦膜組織形態(tài)。

肉食要減少。我國近十年腸癌和乳腺癌發(fā)病率上升很快，這些癌癥都屬于“西方型腫瘤”，主要原因就在于肉食過多，身體中攝入過多脂肪和熱量，導(dǎo)致膽汁酸和牛黃膽酸等過多、內(nèi)分泌失調(diào)而誘發(fā)腫瘤。另外，治未病很重要的是戒煙、限酒。

除正常對照組外，其余三組大鼠均造模后5～10 min開始出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多、煩躁不安的現(xiàn)象，均在31～60 min達(dá)到高峰。大約60 min后頭風(fēng)顆粒治療組和預(yù)防組的動(dòng)物活動(dòng)逐漸減少，90 min后模型組動(dòng)物活動(dòng)開始減少，90～120 min及120～150 min時(shí)間段治療組、預(yù)防組撓頭次數(shù)與模型組比較，減少明顯。150 min后頭風(fēng)顆粒治療組和預(yù)防組大鼠逐漸趨于正常。模型組大鼠上述現(xiàn)象持續(xù)時(shí)間較長，持續(xù)約3 h，大鼠活動(dòng)逐漸減少。

1.2.3 標(biāo)本制備 常溫下，用10%水合氯醛3.5 mL/kg對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，充分放血后，超凈工作臺冰上迅速斷頭，取部分系著腦膜的顱骨放入4%多聚甲醛(4 ℃)中備用。然后完整取出鼠腦，迅速剝離出中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)，放入1.5 mL滅菌的離心管，標(biāo)記后置于液氮內(nèi)冷凍保存。

偏頭痛的發(fā)作與多種因素有關(guān)，包括遺傳、飲食、內(nèi)分泌以及精神因素等，其發(fā)病機(jī)制至今尚未明了，較為公認(rèn)的有三叉神經(jīng)血管學(xué)說、皮層擴(kuò)散性抑制學(xué)說。近年來研究較多的是三叉神經(jīng)血管學(xué)說[2]，該學(xué)說概括偏頭痛的發(fā)病機(jī)制為以下三個(gè)方面：腦膜血管擴(kuò)張、神經(jīng)源性炎癥形成、中樞神經(jīng)元功能異常[3-4]。偏頭痛動(dòng)物模型種類較多，其設(shè)計(jì)原理均是根據(jù)偏頭痛發(fā)病機(jī)制而來，應(yīng)用較廣泛的為硝酸甘油型偏頭痛動(dòng)物模型。硝酸甘油型偏頭痛模型屬于神經(jīng)血管反射機(jī)制模型，此模型操作技術(shù)簡單，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)、易于獲得，模型癥狀與偏頭痛臨床癥狀相似性好，造模因素單一穩(wěn)定，可在短期內(nèi)大量復(fù)制[5]。本項(xiàng)目中，采集硝酸甘油型偏頭痛模型中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)標(biāo)本，通過蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察各組大鼠腦膜組織形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠腦膜毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，血漿蛋白外滲，血管周圍肥大細(xì)胞脫顆粒，大量炎性細(xì)胞滲出，這些現(xiàn)象也證實(shí)了皮下注射硝酸甘油可引起腦膜毛細(xì)血管擴(kuò)張、神經(jīng)源性炎癥形成，給藥干預(yù)組較模型組上述現(xiàn)象明顯減輕，可見頭風(fēng)顆粒能顯著減輕硝酸甘油引起的神經(jīng)性炎癥。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

作為與醫(yī)學(xué)相關(guān)聯(lián)的學(xué)科，藥學(xué)教育的目標(biāo)是培養(yǎng)從事藥物研發(fā)和藥學(xué)服務(wù)的專業(yè)人才。目前世界多國為加強(qiáng)藥學(xué)生的職業(yè)責(zé)任感，均采用了宣誓儀式。

2 結(jié)果

2.1 大鼠癥狀行為學(xué)變化

中國在維和行動(dòng)中的領(lǐng)導(dǎo)決策能力尚未得到有效體現(xiàn)。在當(dāng)今世界，國際規(guī)則往往由一些發(fā)達(dá)國家制定，在國際安全領(lǐng)域的聯(lián)合國維和行動(dòng)也不例外，很多情況下，維和人員派遣國無法充分參與維和行動(dòng)各階段的所有工作。一些國家（其中大部分為發(fā)展中國家）提供了大部分維和人員，卻很少有機(jī)會參與維和決策，他們提供的一些有價(jià)值的意見也很少被采納。中國作為參與國，因受種種因素的限制，在維和行動(dòng)中很難起到主導(dǎo)作用。

2.2 大鼠腦膜組織形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡下可見c-fos、c-jun免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元細(xì)胞呈棕黃色，主要分布在PAG區(qū)，尤其在PAG的腹外側(cè)區(qū)，且呈雙側(cè)對稱分布(鏡檢圖片見圖5-12，200X)。正常對照組大鼠PAG區(qū)可見一定陽性細(xì)胞，偏頭痛模型組大鼠PAG區(qū)c-fos和 c-jun陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與正常對照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與偏頭痛模型組比較，頭風(fēng)顆粒治療組和預(yù)防組c-fos和c-jun陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表1。

圖1 正常組

圖2 模型組

圖3 預(yù)防組

圖4 治療組

2.3 頭風(fēng)顆粒對偏頭痛模型大鼠PAG區(qū)c-fos、c-jun mRNA表達(dá)的影響

應(yīng)用 real-time PCR方法檢測各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的c-fos、c-jun mRNA的表達(dá)。c-fos、c-jun mRNA相對表達(dá)量，以正常對照組為1，各組大鼠PAG區(qū)c-fos mRNA相對表達(dá)量見圖5，各組大鼠PAG區(qū)c-jun mRNA相對表達(dá)量見圖6。與正常對照組相比，偏頭痛模型組大鼠PAG區(qū)c-fos、c-jun mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)；與偏頭痛模型組比較，頭風(fēng)顆粒預(yù)防組和頭風(fēng)顆粒治療組大鼠PAG區(qū)c-fos和c-jun mRNA表達(dá)明顯減弱。

注：正常對照組1，模型組5.310652，治療組1.439488，預(yù)防組1.174643

注：正常組1，模型組5.798001，治療組1.665038，預(yù)防組1.262835

2.4 各組大鼠PAG區(qū)c-fos和 c-jun陽性細(xì)胞數(shù)比較

鏡下觀察腦膜毛細(xì)血管、炎性細(xì)胞滲出現(xiàn)象及組織細(xì)胞形態(tài)(圖1、圖2、圖3、圖4)。正常對照組：毛細(xì)血管正常，腦膜組織結(jié)構(gòu)緊密。模型組：毛細(xì)血管擴(kuò)張，組織水腫，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)疏松，大量炎性細(xì)胞滲出。頭風(fēng)顆粒治療組：腦膜血管擴(kuò)張不明顯，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)較疏松，有少量炎性細(xì)胞滲出。頭風(fēng)顆粒預(yù)防組：毛細(xì)血管擴(kuò)張不明顯，部分血管周圍有少量炎性細(xì)胞滲出。

組別動(dòng)物(只)c-fos(個(gè))c-jun(個(gè))正常對照組 1211.96±0.9213.32±0.61偏頭痛模型組 1282.96±2.08?88.53±1.25?頭風(fēng)顆粒預(yù)防組1223.44±1.59△27.81±1.46△頭風(fēng)顆粒治療組1222.90±1.15△24.58±0.74△

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與偏頭痛模型組比較，△P<0.01。

2.5 各組大鼠PAG區(qū) c-fos和c-jun陽性細(xì)胞灰度比較

與正常對照組比較，偏頭痛模型組c-fos和c-jun陽性細(xì)胞灰度減弱，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與偏頭痛模型組比較，頭風(fēng)顆粒治療組和預(yù)防組c-fos和 c-jun陽性細(xì)胞灰度明顯增強(qiáng)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

組別動(dòng)物(只)c-fosc-jun正常對照組 12241.06±1.91237.79±2.91偏頭痛模型組 12193.26±1.48?181.61±1.64?頭風(fēng)顆粒預(yù)防組12222.63±2.71△216.68±2.27△頭風(fēng)顆粒治療組12227.79±2.17△219.89±1.86△

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與偏頭痛模型組比較，△P<0.01。

3 討論

1.2.6 鏡檢和圖像分析 光鏡下，陽性細(xì)胞細(xì)胞核染色體呈現(xiàn)棕黃色，多為圓形或者卵圓形。在200倍光鏡下全面觀察切片，隨機(jī)選取各組大鼠腦部切片上端和下端不重復(fù)的6個(gè)視野，對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，利用Leica DM480圖像分析軟件分析每張切片上每個(gè)視野的平均灰度。

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)是位于中腦頂蓋與被蓋之間，環(huán)繞中腦導(dǎo)水管周圍的一片區(qū)域，其頭側(cè)起自后聯(lián)合水平，尾側(cè)達(dá)藍(lán)斑核首側(cè)水平[6]。PAG具有極其復(fù)雜功能，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中較重要結(jié)構(gòu)，它參與痛覺調(diào)控，還與恐懼、焦慮、自主神經(jīng)功能、睡眠等的調(diào)控活動(dòng)密切相關(guān)[7]。作為重要的痛覺調(diào)整中樞[8]，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)既可接收來自脊髓和延髓的傷害性刺激，將疼痛信息向上傳遞至更高級中樞，又可抑制過度疼痛信息的下行傳遞[9]。

一般將PAG分為四個(gè)區(qū)：內(nèi)側(cè)區(qū)、腹外側(cè)區(qū)、背外側(cè)區(qū)和背側(cè)區(qū)。PAG腹外側(cè)區(qū)在深部結(jié)構(gòu)的傷害性疼痛信息處理中起重要作用，Tassorelli等[10]發(fā)現(xiàn)刺激中腦導(dǎo)水管腹外側(cè)區(qū)可出現(xiàn)情緒低落、心動(dòng)過緩、低血壓等自主神經(jīng)功能紊亂癥狀，而以上這些自主神經(jīng)紊亂癥狀在偏頭痛發(fā)作時(shí)也伴隨出現(xiàn)；Raskin[11]研究中發(fā)現(xiàn)，在一組非偏頭痛患者PAG區(qū)植入刺激電極后出現(xiàn)偏頭痛樣頭痛發(fā)作，最早提出PAG為人類偏頭痛疼痛的中樞來源。另外，組織形態(tài)學(xué)[12]、影像學(xué)研究[13-14]等也有相關(guān)PAG與疼痛關(guān)系研究，均提示PAG在偏頭痛發(fā)病中具有重要作用。

即早基因c-fos、c-jun與痛覺調(diào)控關(guān)系密切，諸多研究表明，疼痛、創(chuàng)傷等傷害性刺激可誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)即早基因家族c-fos、c-jun的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)研究中，偏頭痛模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)c-fos常被作為神經(jīng)元激活的標(biāo)記物。在即早基因與偏頭痛的關(guān)系研究中，Moskowitz[15]研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛發(fā)作可刺激三叉神經(jīng)核尾核細(xì)胞內(nèi)即早基因c-fos、c-jun大量表達(dá)，當(dāng)服用治療藥物舒馬曲坦后，其表達(dá)受到了抑制；Cristina等[16]研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛發(fā)作時(shí)，下丘腦、腦干等處c-fos基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，劉斌等[17]研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛模型大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、下丘腦 c-fos、c-jun基因表達(dá)增強(qiáng)。任永新等[18]研究證實(shí)偏頭痛大鼠模型腦干、下丘腦c-fos、c-jun基因表達(dá)增強(qiáng)，中藥頭風(fēng)飲能顯著抑制基因高表達(dá)。

本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：硝酸甘油型偏頭痛動(dòng)物模型造模成功，造模后大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多等癥狀行為學(xué)變化；鏡下觀察大鼠腦膜血管擴(kuò)張，神經(jīng)性炎癥形成；RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)c-fos和 c-jun mRNA表達(dá)增強(qiáng)，中藥頭風(fēng)顆粒預(yù)防給藥和治療給藥均能抑制其基因表達(dá)。與正常對照組相比，偏頭痛模型組c-fos和c-jun mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)、c-fos和c-jun陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多；與偏頭痛模型組比較，頭風(fēng)顆粒治療組和頭風(fēng)顆粒預(yù)防組c-fos和c-jun mRNA表達(dá)明顯減弱，c-fos和c-jun陽性細(xì)胞數(shù)減少，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01，說明頭風(fēng)顆?？梢韵抡{(diào)PAG區(qū)c-fos和 c-jun基因表達(dá)，從而抑制痛覺信息的傳遞，從而發(fā)揮治療和預(yù)防偏頭痛的作用。

3.1 通過綜合實(shí)踐對單項(xiàng)課程的知識與技能進(jìn)行融合 通過綜合實(shí)踐課程建設(shè)將原本被課程割裂的知識與技能進(jìn)行深度融合，幫助學(xué)生整合現(xiàn)有的知識結(jié)構(gòu)，以解決實(shí)際問題，讓學(xué)生能夠與具體工作領(lǐng)域的任務(wù)相對接。

綜上所述，頭風(fēng)顆粒可以明顯減輕硝酸甘油引起的神經(jīng)性炎癥，顯著抑制偏頭痛大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)c-fos、c-jun基因表達(dá)，改善偏頭痛模型大鼠癥狀行為學(xué)變化，從分子機(jī)制上闡明了頭風(fēng)顆粒預(yù)防和治療偏頭痛的作用機(jī)理。