張廣樂， 苗永旺

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STATs)家族是首次從干擾素中發(fā)現(xiàn)的一種與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子家族。目前該家族中包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6 7個成員，分子量大小為80～113 kD，它們氨基酸序列相似，編碼750～850個氨基酸。在哺乳動物中，STATs家族中除了STAT2以外，其他的6個成員均與乳腺發(fā)育以及乳汁的產(chǎn)生有關(guān)，其中以STAT5最為重要[1]。目前該基因在奶牛、水牛和奶山羊的乳腺發(fā)育以及泌乳性狀的研究上均有報道。在?？莆锓N泌乳性狀研究中STAT5被視為重要的功能候選基因。對該基因進(jìn)行深入研究有利于解析動物的泌乳機(jī)制，對奶牛的營養(yǎng)調(diào)控及其選育利用具有重要意義。

1 STAT5基因的結(jié)構(gòu)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription，STAT5)是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族(signal transducer and activator of transcription，STATs)的重要成員，STAT5包括STAT5A和STAT5B2個不同的基因[2-3]。STAT5A最初是從小鼠的乳腺核提取物中發(fā)現(xiàn)的，它是一種能與β-酪蛋白基因啟動子結(jié)合的特異性核因子，起初命名為乳腺因子(mammary gland factor，MGF)[4]。隨后人們又從綿羊的乳腺組織中分離得到STAT5B，相繼STAT5B基因也在小鼠、大鼠、人類和牛中被發(fā)現(xiàn)[3,5-7]。STAT5A和STAT5B在蛋白質(zhì)水平上存在著90%的相似性，因此二者被認(rèn)為是基因重復(fù)的結(jié)果[3,8]。普通牛中STAT5A和STAT5B基因均于19號染色體上，兩者相距40 kb[9]。NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)預(yù)測普通牛的STAT5A存在1個轉(zhuǎn)錄本，而STAT5B存在5個轉(zhuǎn)錄本，各轉(zhuǎn)錄本的差別在于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)的不同。目前從NCBI數(shù)據(jù)庫中可以檢索到普通牛、水牛、山羊、綿羊等?？莆锓N的STAT5A和STAT5B基因的序列。序列對比發(fā)現(xiàn)普通牛與水牛STAT5A基因的氨基酸序列相似度為99%，與山羊、綿羊的氨基酸序列相似度為98%。而黃牛與水牛STAT5B基因的氨基酸序列相似度為97%，與山羊、綿羊的氨基酸序列相似度為96%。

STAT5A和STAT5B在結(jié)構(gòu)上相似，功能上互補(bǔ)[10-11]。它們存在著6個相同的保守結(jié)構(gòu)域(圖1)：①N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)，NTD參與非磷酸化的STAT單體的二聚反應(yīng)，促進(jìn)STATs與共轉(zhuǎn)錄激活因子之間的相互作用，并且在涉及酪氨酸磷酸化的STATs的核導(dǎo)入和失活中起著重要作用；②螺旋線圈結(jié)構(gòu)域(spiral coil domain，CCD)，CCD使STATs與不同的蛋白質(zhì)相互作用，該結(jié)構(gòu)域主要參與某些蛋白質(zhì)的負(fù)調(diào)控；③由β-免疫球蛋白折疊而成的DNA結(jié)合域(DNA binding domain，DBD)，不同的基因通過STATs上的DBD與STATs結(jié)合；④Src同源結(jié)構(gòu)2(Src homologous structure 2，SH2)，該結(jié)構(gòu)域是STATs中最為保守的結(jié)構(gòu)域，SH2結(jié)構(gòu)域是受體結(jié)合和酪氨酸磷酸二聚體形成所必需的。這個區(qū)域內(nèi)的殘基對于由STATs介導(dǎo)的一些細(xì)胞功能以及鄰近這個區(qū)域的殘基功能非常重要。已有研究表明，STAT5二聚化所需的關(guān)鍵酪氨酸殘基分別為Tyr649和Tyr699[12-14]。⑤α螺旋連接域(the spiral connection domain，LD)，LD連接著DBD和SH22個結(jié)構(gòu)域。LD也在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起作用，并與靜息細(xì)胞中非磷酸化STATs的組成核質(zhì)穿梭有關(guān)。⑥轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain，TAD)，位于羧基末端，TAD與多種蛋白質(zhì)相互作用，該結(jié)構(gòu)域在家族成員之間的差異較大，這與每一個成員相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的不同有關(guān)(Genbanck)。STAT5A和STAT5B的不同之處是主要在于羧基末端(C端)的差異，STAT5B中的C端的8個氨基酸與STAT5A完全不同，而且在C端STAT5B也比STAT5A缺少12個氨基酸[15]。

注：STAT5A和STAT5B僅NTD結(jié)構(gòu)域不同，其余結(jié)構(gòu)域共有。圖1 STAT5蛋白結(jié)構(gòu)簡易模式圖

2 STAT5基因的調(diào)控途徑

JAK2(Janus kinase 2)是Janus激酶(JAK)家族成員之一。在哺乳動物中，PRL-JAK2-STAT5信號通路是參與乳腺發(fā)育和泌乳過程的主要路徑之一[16]。與其他家族成員相同，正常的生理情況下STAT5存在于細(xì)胞質(zhì)中且無生理活性，但是當(dāng)催乳素(prolactin，PRL)與其受體(prolactin receptor，PRLR)結(jié)合后使得與STAT5相偶聯(lián)的 JAK2被激活，隨后在SH2結(jié)構(gòu)域上的關(guān)鍵酪氨酸殘基(STAT5A的Try649和STAT5B的Try699)與JAK2 的作用下實(shí)現(xiàn)STAT5磷酸化活化，磷酸化的STAT5蛋白從受體上解離下來形成同源或者異源STAT5-STATx二聚體轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步促進(jìn)與乳成分相關(guān)基因的表達(dá)[13]。Gouilleux等人[17]研究發(fā)現(xiàn)，在體外激活催乳素受體后，酪氨酸特異性磷酸化與STAT5-DNA應(yīng)答元件的結(jié)合能力會受到JAK2的影響。STAT5的轉(zhuǎn)錄激活與CREB結(jié)合蛋白/p300(CBP/p300)也密切相關(guān)，CBP/p300可以結(jié)合STAT5的羧基末端反式激活結(jié)構(gòu)域，并且p300負(fù)責(zé)增強(qiáng)STAT5A和STAT5B的轉(zhuǎn)錄活性[18]。使用酵母雙雜交測定和COS7細(xì)胞的免疫共沉淀的體外研究已經(jīng)顯示CBP/p300以PRL誘導(dǎo)的方式與STAT5相互作用。核受體輔活化子1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA-1)是一種細(xì)胞核輔助活化因子，并且已經(jīng)通過STAT5A和NCOA-1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NCOA-1與STAT5可以相互作用，并且通過染色質(zhì)免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)，STAT5A/NCOA-1復(fù)合物與CISH(細(xì)胞因子誘導(dǎo)的含SH2蛋白)啟動子中的STAT5結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合[19]。

細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(cytokine signal transduction inhibitor，SOCS)家族是細(xì)胞因子信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子家族，具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程的潛力。SOCS蛋白家族包含細(xì)胞因子誘導(dǎo)的含SH2域蛋白(the cytokine-inducible SH2domain-containing protein，CIS)和SOCS1～SOCS7 8個成員[20]。所有成員共有3個保守結(jié)構(gòu)域：1個長度和序列不同的N端區(qū)域、1個中心SH2結(jié)構(gòu)域和1個保守的C端SOCS盒[20-21]。SOCS蛋白可識別細(xì)胞因子受體或相關(guān)的JAK，并通過直接干擾信號傳導(dǎo)和靶向受體復(fù)合物進(jìn)行泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解來減弱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。近年研究發(fā)現(xiàn)，該家族中的SOCS1、SOCS3和CIS在由生長激素(GH)、催乳素(PRL)等誘導(dǎo)的JAK2-STAT5途徑中發(fā)揮抑制作用，并且這種抑制屬于競爭性的[23]。SOCS家族成員與STAT5擁有相同的SH2結(jié)構(gòu)域，該域是JAK2-STAT5途徑磷酸化所必須的結(jié)構(gòu)域，當(dāng)SOCS存在時，就會以自身的SH2結(jié)構(gòu)域與STAT5競爭磷酸化位點(diǎn)，以此來抑制JAK2-STAT5途徑發(fā)揮生物學(xué)功能[23]。Ram等人用SOCS家族中的5個成員(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS6和CIS)對非洲綠猴腎細(xì)胞(COS細(xì)胞)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOCS1和SOCS3在GH-JAK2-STAT5信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著高效抑制作用，CIS和SOCS2抑制效果稍弱，而SOCS6無抑制作用[23]。并且Ram等人還確定了SOCS/CIS抑制GH-JAK2-STAT5信號傳導(dǎo)的3種不同機(jī)制：其中SOCS1作用于JAK2酪氨酸激酶水平，SOCS3作用于生長激素受體(GHR)的膜鄰近酪氨酸殘基333和338水平，以及CIS和SOCS2通過膜遠(yuǎn)端GHR酪氨酸殘基其作用[23]。Tonko等人[24]通過研究CIS和SOCS3蛋白在小鼠乳腺和HC11乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)和功能發(fā)現(xiàn)，兩者的表達(dá)會抑制乳腺上皮細(xì)胞中的STAT5酪氨酸磷酸化。Anderson等人[25]發(fā)現(xiàn)處于功能性黃體溶解時期的妊娠晚期的小鼠，卵巢中STAT5酪氨酸磷酸化的降低與SOCS的最大mRNA表達(dá)量同時發(fā)生，這一結(jié)果與SOCS是STATs信號的負(fù)調(diào)節(jié)因子觀點(diǎn)一致。

圖2 STAT5信號途徑的作用模式

3 STAT5基因在乳腺中的表達(dá)及功能

STAT5是首次從妊娠期和哺乳期小鼠乳腺中提取出的與β-酪蛋白特異性結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄激活因子，并且發(fā)現(xiàn)STAT5與β-酪蛋白的啟動子有2個結(jié)合位點(diǎn)，分別位于啟動子的(-80)～(-100)和(-130)～(-150)之間的2個區(qū)域，而且近端結(jié)合位點(diǎn)是催乳素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄所必須的[4]。為深層次闡明其表達(dá)規(guī)律及其功能，研究者們在小鼠以及其他哺乳動物中做了進(jìn)一步研究。對乳腺的研究揭示了STAT5在乳腺上皮腺泡細(xì)胞譜系發(fā)育中的作用[26-28]。乳腺的細(xì)胞庫是由激素和細(xì)胞因子協(xié)同作用于干細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生的，乳腺干細(xì)胞具有獨(dú)特的自我更新能力并形成了3個主要譜系：導(dǎo)管和腺泡基底層的肌上皮細(xì)胞，導(dǎo)管管腔內(nèi)的導(dǎo)管上皮細(xì)胞，以及具有大量合成乳蛋白能力的腺泡上皮細(xì)胞[29]。在缺失STAT5的情況下，乳腺組織會以減少乳腺腔祖細(xì)胞群來阻礙腺泡的形成[26,28]。STAT5不僅是腺泡細(xì)胞的增殖和存活所必需的，對導(dǎo)管的發(fā)育也存在著一定的影響。缺失STAT5基因的乳腺組織盡管原發(fā)性導(dǎo)管延伸正常，但導(dǎo)管側(cè)支的發(fā)育會受到損傷[30]。并且研究表明，低濃度的STAT5只能確保腺泡上皮的擴(kuò)張，只有高濃度的STAT5才能使乳腺完成最終產(chǎn)奶的分化程序[10]。研究發(fā)現(xiàn)哺乳前10 d缺乏STAT5基因的雌鼠，乳腺中的腺泡占有率下降了50%，STAT5嚴(yán)重缺陷者會造成腺泡終末分化失敗無法泌乳[2,31]。類生長E74因子5(E74-like factor 5，ELF5)位于PRL-JAK2-STAT5信號通路中STAT5的上游，當(dāng)ELF5缺失后會使STAT5的結(jié)構(gòu)受損，從而影響正常小葉泡狀細(xì)胞發(fā)育最終導(dǎo)致泌乳失敗[30,32]。由此可見，STAT5基因在乳腺發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的功能。

乳蛋白是乳汁的重要成分，F(xiàn)araci-Orf等人[33]通過對小鼠乳腺HC11細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HC11細(xì)胞受到催乳素刺激后，乳蛋白基因(如：β-酪蛋白)的轉(zhuǎn)錄激活是由酪氨酸磷酸化的STAT5A和STAT5B所介導(dǎo)的。Liu等人[11]發(fā)現(xiàn)STAT5A缺陷的雌性小鼠在分娩后不能分泌乳酸，并且乳清蛋白(whey protein，WAP)基因的表達(dá)也會受到相應(yīng)的影響。Yang等人[34]對將幼子移除1 d的哺乳期雌鼠乳腺中的STAT5基因的活性進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)與幼子移除前相比基因的活性明顯降低。Reichenstein等人[31]發(fā)現(xiàn)，哺乳前10 d缺乏STAT5基因的雌鼠的乳腺中WAP和α-乳清蛋白的表達(dá)量分別降低39%和23%。有研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠的STAT5基因敲除后，小鼠乳汁分泌量急劇下降甚至造成泌乳失敗[35-36]?？梢?，STAT5基因在乳汁生成的起始階段發(fā)揮著重要作用。

STAT5基因不僅在小鼠的泌乳性狀上有所研究，在?？莆锓N的乳腺發(fā)育以及乳汁生成領(lǐng)域也有突破。郝志云等人[37]采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對綿羊的STAT5A基因進(jìn)行了多組織表達(dá)檢測，結(jié)果顯示在藏綿羊和小尾寒羊2個品種中，STAT5A基因在所有組織中都有表達(dá)，但是在各自乳腺組織中的表達(dá)量均高于其他組織。Wakao等人[10]通過對綿羊STAT5研究發(fā)現(xiàn)，STAT5基因在母羊妊娠期、哺乳期和泌乳后期表達(dá)都高度上調(diào)，其中以哺乳期最為明顯。以往研究表明，STAT5與泌乳后相隔時間和擠奶速度也有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)奶牛在擠奶24 h后，乳腺中STAT5-DNA結(jié)合活性開始降低，直到72 h以后DNA結(jié)合活性降低為0[34]。Murney等[38]通過對奶牛擠奶速度的對比發(fā)現(xiàn)，將擠奶速度提升到正常速度的4倍時，乳腺中STAT5 mRNA豐度明顯升高，并且STAT5 mRNA豐度與乳蛋白含量成正相關(guān)。李勝等人[39]通過對水牛STAT5A和STAT5B兩基因進(jìn)行了多組織表達(dá)譜檢測，結(jié)果顯示兩者在所有組中都表達(dá)，其中STAT5A在乳腺組織中表達(dá)最高，STAT5B在小腦中表達(dá)最高。檳榔江水牛是我國特有的乳用型水牛，為驗(yàn)證STAT5基因是否與水牛泌乳性狀相關(guān)，本課題組以檳榔江水牛為對象，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對處于泌乳期和非泌乳期的STAT5A和STAT5B2個基因進(jìn)行了乳腺組織表達(dá)譜檢測，結(jié)果顯示，兩者在泌乳期的表達(dá)量均高于非泌乳期(待發(fā)表數(shù)據(jù))。綜上所述，STAT5基因無論是在乳腺的正常發(fā)育還是泌乳的整個過程中都發(fā)揮著重要作用。

4 Stat5多態(tài)性及對泌乳性狀的影響

PRL-JAK2-STAT5信號通路在乳腺中催乳素信號傳導(dǎo)過程中占有核心地位，因此STAT5基因與泌乳性狀是相關(guān)的。何峰等人[40]采用PCR-SSCP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，STAT5A基因在中國荷斯坦奶牛中存在1個堿基突變(9051：A>G)和2個連鎖突變點(diǎn)(12440：T>C和12550處的插入/缺失)。通過方差分析統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)前者對乳蛋白率有顯著影響(P<0.05)，后者產(chǎn)奶量有極顯著影響(P<0.01)，對乳脂量、乳蛋白量有顯著影響(P<0.05)。Khatib等人[41]通過對荷斯坦奶牛STAT5A基因SNP檢測發(fā)現(xiàn)，SNP1295的等位基因G與乳蛋白和乳脂率的顯著降低以及胚胎存活率有關(guān)。鮑斌等人[42]利用PCR-SSCP技術(shù)對中國荷斯坦牛STAT5A基因進(jìn)行了群體遺傳學(xué)檢測，結(jié)果顯示，STAT5AP1位點(diǎn)存在AA、GG和AG 3種基因型，并且不同基因型對第1胎產(chǎn)奶量、乳蛋白率和第2胎乳蛋白率有顯著影響；STAT5AP2位點(diǎn)存在CC、TT和CT 3種基因型，不同的基因型對第2胎乳蛋白率存在影響。STAT5基因不僅在荷斯坦奶牛中存在多態(tài)性，在其他?？莆锓N中也發(fā)現(xiàn)存在多態(tài)性。Pawel等人[43]利用SSCP方法對澤西牛的STAT5A進(jìn)行了多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GG基因型奶牛產(chǎn)奶量最高，而AA和AG基因型奶牛乳蛋白含量高于GG型奶牛。Maria等人[44]研究了意大利褐牛STAT5A/Aval的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在該基因的外顯子7內(nèi)存在1個C>T取代，為了驗(yàn)證STAT5A/Aval的多態(tài)性與泌乳性狀的關(guān)系，他們對305 d奶牛生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示CC型奶牛產(chǎn)奶量高于CT型，但是CC型奶牛的乳蛋白含量卻高于CT型奶牛。An等人[45]在薩農(nóng)能和關(guān)中山羊的STAT5A基因中檢測到了1個C>T堿基替換，并且發(fā)現(xiàn)CT基因型山羊的產(chǎn)奶量高于CC型山羊。盧武洲等人[46]采用PCR直接測序法對沼澤型水牛與河流型水牛的STAT5A基因的部分外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行了核苷酸多態(tài)性檢測，結(jié)果顯示，篩選出的SNP位點(diǎn)在兩種水牛中呈現(xiàn)出不同的群體遺傳特征，這些SNP位點(diǎn)主要存在于河流型水牛中。河流型水牛為乳用型水牛，STAT5A基因這些特有的SNP位點(diǎn)是否與水牛的泌乳性狀有關(guān)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。季敏等人[47]采用直接測序和PCR-RFLP技術(shù)研究檳榔江水牛STAT5A基因變異，結(jié)果顯示檳榔江水牛STAT5A基因存在高度多態(tài)性，并且這些多態(tài)性與產(chǎn)奶量以及乳脂率等產(chǎn)奶性狀呈顯著相關(guān)。綜上所述STAT5基因的多態(tài)性可以作為改良?？莆锓N泌乳性狀的一個遺傳標(biāo)記。

5 ?？莆锓N未解決的問題及展望

眾多研究表明，STAT5基因與動物的乳腺發(fā)育以及泌乳性狀有關(guān)，同時在機(jī)體免疫、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、癌變以及生物二態(tài)性方面也發(fā)揮著重要作用。但是當(dāng)前關(guān)于STAT5基因的研究和應(yīng)用中依然存在著一些問題有待解決。例如：目前對于該基因在?？莆锓N的研究多數(shù)僅限于對乳腺發(fā)育以及外顯子的SNP對泌乳性狀的影響，對于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的SNP對泌乳性狀的影響未見報道。同時STAT5對于牛科物種的疾病(如：乳腺炎)研究也鮮有報道，而且主要側(cè)重對STAT5A的研究，對STAT5B的研究較少。STAT5A和STAT5B在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)具有高度同源性，推斷其生物學(xué)功能也有相同之處，在小鼠中已有研究證實(shí)兩者在功能上存在互補(bǔ)效應(yīng)。然而這種互補(bǔ)效應(yīng)在?？莆锓N上是否存在還有待驗(yàn)證。由NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，STAT5B在?？莆锓N中的轉(zhuǎn)錄本多于STAT5A，生物學(xué)研究表明同一基因的不同剪接體的生物學(xué)功能也存在差異，STAT5B基因在?？莆锓N乳腺組織中是否存在多種不同的剪接體，在泌乳性狀中是否發(fā)揮不同的作用需進(jìn)一步研究。因此還需對STAT5基因的作用機(jī)制進(jìn)行深層次的研究，探究其對于?？莆锓N的乳腺疾病有何影響。目前國內(nèi)外對于該基因主要集中于對奶牛和奶山羊的研究上，而在奶水牛的研究中鮮有報道。針對水牛的乳腺發(fā)育以及泌乳性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，闡明該基因的變異對泌乳性狀的影響，可為奶水牛的選種選育提供一定的理論依據(jù)。