伍麗仙， 陳永玻， 王成高， 張立喜， 趙 敏，龍 俊， 佟萬祥， 和占星

(1.云南文山州畜牧站，云南 文山 663099；2.云南文山州動物疫病預防控制中心，云南 文山 663099；3.云南馬關縣畜牧技術推廣工作站，云南 馬關 663700；4.云南省草地動物科學研究院，昆明 650212)

德系西門塔爾牛(弗萊維赫牛)是由瑞士西門塔爾牛和德系紅荷斯坦牛雜交，并引入部分其他品種血液選育而成[1]，是世界著名的乳肉兼用牛品種之一[2]。弗萊維赫牛遺傳穩(wěn)定，具有產(chǎn)奶和產(chǎn)肉性能高，適應性強等優(yōu)良特性[3-4]，與其他品種牛雜交后，更能體現(xiàn)出其優(yōu)越性，對改良中國黃牛具有積極的意義[5]。我國自2008年啟動“德系西門塔爾乳肉兼用牛區(qū)域試驗示范推廣項目”，通過引進德國優(yōu)良的乳肉兼用德系西門塔爾牛冷凍精液與中國西門塔爾牛及其雜交牛、黃牛等進行雜交，大大提高了中國西門塔爾牛及其雜交牛等群體的日增重、產(chǎn)肉性能和產(chǎn)奶性能，雜交改良效果好，綜合養(yǎng)殖效益明顯，適合在我國推廣應用[2,6-7]。我國已從德國引進弗萊維赫牛胚胎，通過胚胎移植獲得純種后代，并對純種牛進行培育、生產(chǎn)胚胎和凍精，經(jīng)快速擴繁，增加種群數(shù)量，或用凍精改良我國奶牛和肉牛的方式，逐步在全國范圍內(nèi)推廣應用該品種[3,6,8-12]。文山牛(Wenshan cattle)又名文山高峰牛，屬役肉兼用型黃牛遺傳資源，其具有體軀結(jié)實，繁殖力強，耐粗飼、適應性強，肌肉發(fā)達、皮薄骨細、肉質(zhì)好等優(yōu)點。主產(chǎn)區(qū)為云南省文山壯族苗族自治州廣南、富寧、邱北、硯山等縣海拔900 m以上的地區(qū)[13]，以廣南縣、富寧縣結(jié)合部的百樂、格當、花榜、下枝梅等地所產(chǎn)的為典型品種代表[14]。文山牛1987年錄入《云南省家畜家禽品種》，2011年被列入《中國畜禽遺傳資源志·牛志》，2014年獲農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記證書。文山州作為云南省打造世界一流“綠色食品牌”肉牛產(chǎn)業(yè)的重點地區(qū)，牛存欄和出欄數(shù)一直位居云南省16州市前列，2019年文山牛存欄76.11萬頭，其中能繁母牛存欄23.79萬頭。文山州是云南省率先開展肉牛雜交改良的地區(qū)之一，雜交改良牛存欄數(shù)較多。家畜胚胎生物技術是優(yōu)良家畜快速擴繁、新品種培育及遺傳資源生物多樣性保護的有效技術之一。近30多年來，牛胚胎生物技術的研究應用取得了重大進展，2011 年全世界生產(chǎn)牛體內(nèi)胚胎73.3萬枚，移植受體牛 57.2萬頭次[15]。自20世紀70年代以來，我國家畜胚胎移植研究與應用取得重要進展，云南省牛胚胎移植的研究始于20世紀80年代末，奶牛、肉牛胚胎移植先后獲得成功，并得到應用[16-19]。近幾年來河北、山東等開展了弗萊維赫牛胚胎移植工作，并獲得成功[8-12]。為全面推動馬關縣的肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展，提高肉牛品質(zhì)，縮短品種改良年限，文山州馬關縣引進德系乳肉兼用型西門塔爾牛胚胎，以文山牛及雜交母牛為受體進行胚胎移植“借腹懷胎”，開展了肉牛胚胎移植技術的應用及效果研究，現(xiàn)總結(jié)如下，謹供參考。

1 材料與方法

1.1 胚胎來源

德國乳肉兼用型西門塔爾牛凍胚由新疆動物胚胎工程技術研究中心提供。

1.2 藥品試劑

喜達(CIDR)孕酮陰道緩釋劑(1.38 g孕酮/支，寧波三生藥業(yè)有限公司)；氯前列醇注射液(寧波三生藥業(yè)有限公司)；鹽酸利多卡因(山東華魯制藥有限公司)；新潔爾滅(昆明興中制藥廠)；維生素ADE注射液(中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所)。

1.3 器 材

專用埋栓槍、解凍杯、胚胎移植槍等。

1.4 受體牛的選擇

在文山州馬關縣大訊肉牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社、馬關縣都龍康達肉牛養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社等共12個肉牛養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)牛場飼養(yǎng)的牛群中選擇年齡2～10歲、體重300 kg以上的西本雜(西門塔爾♂×文山黃?！?、短本雜(短角?！帷廖纳近S?！?和本地黃牛母牛600頭，從中選擇空懷、產(chǎn)犢3個月以上，生殖器官發(fā)育良好、發(fā)情周期正常、無生殖系統(tǒng)疾病的270頭健康母牛作為受體供同期發(fā)情處理。

1.5 受體牛的同期發(fā)情處理

采用CIDR+PG法進行受體同期發(fā)情處理，具體處理程序為：第1天在母牛陰道內(nèi)插入(埋植)CIDR孕酮陰道栓1個/頭(在性周期的任一天，除發(fā)情當天外)，同時肌注維生素ADE 5 mL/頭；第8天注射氯前列醇0.6 mg/頭，同時肌注維生素ADE 5 mL/頭；第11天撤出CIDR；第19～21天進行胚胎移植。

1.6 胚胎移植

對同期發(fā)情處理第19～21 d(發(fā)情第7天)的受體牛進行直腸檢查，觸摸卵巢上的黃體,對黃體質(zhì)量較好(A、B級)的采用非手術法進行胚胎移植。

1.7 妊娠檢查

受體牛胚胎移植后60～90 d，經(jīng)直腸檢查進行妊娠診斷。對妊娠的受體牛加強飼養(yǎng)管理。

1.8 試驗時間

2016—2017年分3批進行移植。

1.9 統(tǒng)計分析

移植妊娠率比較采用卡方(x2)；不同性別犢牛的初生重和體尺比較采用t檢驗；不同季節(jié)出生犢牛的初生重和體尺比較采用單因子方差分析。數(shù)值以平均值±標準差表示，并以p<0.05和p<0.01表示分別達到顯著和極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 受體牛同期發(fā)情效果

同期發(fā)情處理受體牛270頭，其中達到移植標準的81頭，占同期發(fā)情處理牛的30.00%，即受體牛經(jīng)同期發(fā)情處理后的可移植率為30%。

2.2 受體牛胚胎移植效果

胚胎移植87頭受體(含選擇自然發(fā)情6頭)，妊娠28頭，平均妊娠率32.18%。

2.2.1 不同品種受體的移植妊娠率比較 表1所示，西本雜受體的移植妊娠率達40.74%，明顯比短本雜受體和文山黃牛受體的分別高18.01百分點和31.65百分點(p<0.01)，短本雜受體的移植妊娠率亦明顯比文山黃牛受體的高13.64百分點(p<0.01)。

表1 不同品種受體的胚胎移植妊娠率

2.2.2 季節(jié)對受體胚胎移植妊娠率的影響 表2所示，受體同期發(fā)情處理后可移植率以春季最高(52.86%)，極顯著高于冬、秋季節(jié)的(p<0.01)；秋季移植受體的妊娠率比春季和冬季的分別極顯著高27.52百分點和36.37百分點(p<0.01)，春季比冬季極顯著高8.86百分點(p<0.01)。表明春季同期發(fā)情處理效果好，而移植妊娠率以秋季高于冬、春季。

2.2.3 自然發(fā)情和同期發(fā)情受體的移植妊娠率比較 表3所示，自然發(fā)情受體的胚胎移植妊娠率極顯著比同期發(fā)情受體的高1.23個百分點(p<0.01)。表明受體牛的移植效果以自然發(fā)情受體更好，但可能與樣本數(shù)少有關。

表2 季節(jié)對受體同期發(fā)情處理效果及胚胎移植妊娠率的影響

表3 自然發(fā)情和同期發(fā)情受體胚胎移植妊娠率比較

2.2.4 受體牛移植單胚和雙胚的妊娠率比較 表4所示，移植雙胚受體牛(n=2)的妊娠率100%，極顯著高于移植單胚受體(n=85)的妊娠率30.59%(p<0.01)，但此次試驗中雙胚移植的樣本數(shù)少，有待進一步研究。

表4 單胚和雙胚移植受體的妊娠率比較

2.3 產(chǎn)犢率

在28頭妊娠受體中流產(chǎn)11頭，流產(chǎn)率39.29%，17頭受體產(chǎn)犢(其中2頭母牛產(chǎn)雙犢)，產(chǎn)犢率60.71%，按移植產(chǎn)犢率為21.84%，共產(chǎn)犢19頭，產(chǎn)犢成活16頭(公犢6頭，母犢10頭)，產(chǎn)犢成活率84.21%。

2.4 犢牛的初生體重和體尺

2.4.1 不同性別犢牛的初生重和體尺的比較 表5所示，公、母犢(n=16)的平均初生重、體高、體斜長、胸圍和管圍分別為33.00 kg，69.50 cm，62.19 cm，72.69 cm和13.50 cm，公犢的體高、胸圍和管圍大于母犢的，體重和體斜長小于母犢的，但公、母犢的體重和體尺分別比較差異不顯著(p>0.05)。

表5 胚胎移植所產(chǎn)犢牛的初生體重和體尺比較

2.4.2 不同季節(jié)出生犢牛的初生體重和體尺比較

表6所示，產(chǎn)犢季節(jié)對犢牛初生體重和體尺有一定的影響。夏季出生犢牛的初生重最小，分別比春、秋和冬季出生的分別輕6.2 kg，3.7 kg和5.4 kg，但差異不顯著(p>0.05)；夏季出生犢牛的體斜長顯著比冬季出生的分別短13.60 cm(p<0.01)，比春季和秋季出生的分別短3.30 cm和10.10 cm(p>0.05)；各季節(jié)出生犢牛的體高、胸圍和管圍分別比較，差異不顯著(p>0.05)。表明產(chǎn)犢季節(jié)對犢牛的體斜長影響較大。

表6 不同季節(jié)出生胚胎移植所產(chǎn)犢牛的初生體重和體尺比較

3 討 論

影響牛胚胎移植妊娠率的因素很多，包括胚胎質(zhì)量等級與胚齡、冷凍與否、移植胚胎的數(shù)量及受體牛的飼養(yǎng)方式、營養(yǎng)狀況與移植時的黃體質(zhì)量、移植季節(jié)、移植人員的技術熟練程度等。

胚胎移植過程中氣候和季節(jié)是必須考慮客觀因素[20]。胡高博[10]研究表明，在春季、秋季節(jié)移植德系西門塔爾牛胚胎的妊娠率分別為60.00%和51.22%，高于夏季和冬季節(jié)的45.56%和44.74%，但差異不顯著；文志平等[21〗研究表明，春、夏、秋、冬的妊娠率分別是61.11%，72.41%，80.00%和25%，在寒冬不宜進行同期發(fā)情、胚胎移植和產(chǎn)犢；陳永昌等[18]研究表明在云南省內(nèi)偏冷涼地區(qū)，夏、秋季是開展胚胎移植的最佳季節(jié)。本研究秋季移植的妊娠率(54.55%)極顯著高于春季和冬季，春季顯著高于冬季的，與前人的報道基本一致。同時，產(chǎn)犢季節(jié)對犢牛的初生體重、體尺有一定影響，體重和體斜長以夏季最小，提示在考慮移植季節(jié)的同時還應考慮到產(chǎn)犢季節(jié)。

黃牛、西黃雜和黑黃雜受體移植荷斯坦牛胚胎的妊娠率分別為49.09%，46.67%和42.86%，差異不顯著[22]。本研究雜種受體的移植妊娠率極顯著高于黃牛受體的，其中以西本雜最高(40.74%)，其次是短本雜受體(22.73%)，黃牛最低至9.09%。這可能與雜種牛的體格較大，膘情好等有關。建議今后開展牛胚胎移植中多選用雜種母牛作為受體，以便獲得更高的妊娠率和產(chǎn)犢率。

移植雙胚是提高胚胎移植妊娠率的措施之一。和占星等[23]在母牛自然交配后第7天在有黃體一側(cè)子宮角移植1枚奶牛IVF凍胚和母牛發(fā)情的第7天在有黃體一側(cè)子宮角同時移植2枚奶牛IVF凍胚，兩者妊娠率均為50%，前者雙胎率50%；桑潤滋等[24]通過移植雙胚胎，獲得的妊娠率和雙胎率分別達61.3%和52.6%；盧克煥等[25]采用體內(nèi)胚胎單側(cè)移植后獲得的妊娠率和雙胎率分別為 65%和50%。本研究對2頭受體移植雙胚獲得的妊娠率和雙胎均為100%，但由于試驗樣本數(shù)過少，有待今后通過加大樣本數(shù)移植進一步探討。

文志平等[21]研究表明，春、夏、秋、冬季節(jié)胚胎移植后受體的流產(chǎn)率分別是31.82%，23.81%，30.55%和100%。本次胚胎移植受體的妊娠率偏低，流產(chǎn)率較高，其主要原因與受體牛飼養(yǎng)管理不到位，諸如飼喂酒糟、頻繁更換飼料、飼料營養(yǎng)差等諸多因素的影響有關。其次是與初期移植時操作熟練程度不夠也有一定的關系。

德系西門塔爾牛具有產(chǎn)奶和產(chǎn)肉性能好、適應性強、雜種優(yōu)勢明顯等特點[2-4,26-27]，利用其胚胎移植獲得純種牛作為種牛，通過人工輸精或本交擴繁，并選擇優(yōu)秀種公牛改良本地黃?；螂s交牛，著力提高雜交后代的生產(chǎn)性能，有利于由單一的肉用或乳用向兼顧乳、肉業(yè)同步發(fā)展，調(diào)動農(nóng)戶養(yǎng)殖母牛的積極性，降低養(yǎng)殖風險，增加經(jīng)濟收入和穩(wěn)定牛源，促進養(yǎng)牛業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

4 結(jié) 論

首次在文山州開展牛胚胎移植并獲得成功。雜交牛受體的移植妊娠率極顯著高于文山牛受體的，秋季移植的妊娠率極顯著高于春季和冬季的。提示以雜交牛為受體在秋季進行胚胎移植可有效提高移植成功率，并且在今后胚胎移植中需加大受體牛的選擇力度和重視受體的同期發(fā)情處理細節(jié)，加強受體牛的全程飼養(yǎng)管理，盡量降低流產(chǎn)率，著力提高移植成功率。本次胚胎移植技術的應用為文山牛的快速擴繁和保種提供了技術支持和積累了寶貴經(jīng)驗。