姜楠，吳云華

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

一氧化氮(NO)是一種理化性質(zhì)十分活潑的氣體小分子，具有調(diào)節(jié)動(dòng)植物多種生理功能的作用[1,2].有研究表明，生物體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生少量 NO[3].內(nèi)源性的NO作為一種信使物質(zhì)，能夠起到調(diào)節(jié)生理功能的作用，作用特點(diǎn)類(lèi)似于激素，即微量的NO具有參與或調(diào)節(jié)生物體生理功能的作用，過(guò)量的NO會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用[4].因此生物體已經(jīng)進(jìn)化出了一系列的機(jī)制以便及時(shí)高效地產(chǎn)生和清除NO.內(nèi)源性NO的清除機(jī)制具有多樣性的特點(diǎn)[5,6].NO的清除機(jī)制之一依賴于NO還原酶，還原酶還原NO為N2O.CYP55B1來(lái)源于萊茵衣藻，屬于細(xì)胞色素P450大家族[7].它除具有P450酶的典型特性外，還能夠?qū)崿F(xiàn)NO的催化還原，該催化反應(yīng)需要NADH提供電子[8-10].戊二醛是傳感器研究領(lǐng)域十分常用的一種同型雙功能交聯(lián)劑，通過(guò)它的兩個(gè)醛基分別與蛋白質(zhì)或酶的氨基結(jié)合，形成酶/受體-戊二醛結(jié)合物[11].本研究基于CYP55B1催化特性，將CYP55B1和牛血清白蛋白混合，同時(shí)加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將混合物交聯(lián)固定在熱解石墨電極表面，構(gòu)建酶生物傳感器CYP55B1/GA/BSA/PGE，并成功的應(yīng)用于NO的催化檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

大腸桿菌菌株DH5α、BL21(DE3)及原核表達(dá)載體pET-28a(+)、pET-28a-55b1均由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析團(tuán)隊(duì)提供.限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III(Takara公司)；瓊脂糖凝膠電泳Marker(東盛生物)；蛋白質(zhì)分子量Marker(Thermo)；30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(摩爾比為29∶1)儲(chǔ)備液、卡那霉素(上海生工)；鎳親和純化柱(康為世紀(jì))；異丙醇δ-氨基-γ-酮戊酸(ALA)和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Alfa Aesar公司；其他試劑均為分析純, 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；一氧化碳?xì)怏w(CO)和氮?dú)?N2，99%)購(gòu)自武漢翔云公司，NO溶液參照文獻(xiàn)[12]制備，制備得到的NO母液濃度為1.8 mmol·L-1，避光密閉保存在帶有橡皮塞的棕色玻璃瓶中.

電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-6D)；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Perkin Elmer，Lambda 750)；CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器)；標(biāo)準(zhǔn)三電極體系：CYP55B1/GA/BSA/修飾的熱解石墨電極為工作電極，甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲為對(duì)電極.

1.2 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法將載體pET-28a(+)和pET-28a-55b1分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，平板活化，挑取單菌落接種至5 mL含有30 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min-1，培養(yǎng)12 h，隨后轉(zhuǎn)接至50 mL TB培養(yǎng)基(含有30 μg·mL-1卡那霉素)中，37 ℃，180 r·min-1，擴(kuò)大培養(yǎng)2 h，至OD值約為0.6，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5 mmol·L-1ALA、1 mmol·L-1IPTG，28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)22 h.

4 ℃、3200 g離心收集菌體，菌體置于冰上預(yù)冷后使其停止蛋白表達(dá).加入6 mL Tris裂解液(pH值8.0，20 mmol·L-1Tris-HCl + 500 mmol·L-1NaCl)重懸菌體, 加入100 μL溶菌酶(10 mg·mL-1)冰上孵育40 min，反復(fù)凍融3次，超聲破碎菌體.4 ℃、13000 g離心20 min，收集上清液，過(guò)0.22 μm濾膜后，過(guò)鎳親和柱純化.冰上孵育結(jié)合1 h后，依次用50、100、150、200、250 mmol·L-1咪唑洗脫液(pH值8.0，含20 mmol·L-1Tris-HCl、500 mmol·L-1NaCl)梯度體積洗脫雜蛋白，并收集每一步的最后1 mL流出液，最后5 mL 500 mmol·L-1咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，收集所有洗脫液，經(jīng)超濾管濃縮，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[13].

1.3 細(xì)胞色素P450 55B1的CO差示光譜測(cè)定

采用CO差示光譜法對(duì)CYP55B1進(jìn)行定量分析[14].取5 mL測(cè)定液和1 mL的P450蛋白液樣品混勻，加入100 μL 0.5 mmol·L-1連二亞硫酸鈉，混勻后于冰上靜置1 min，將上述溶液等量一分為二，分別加入到兩個(gè)比色皿中，在400～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描進(jìn)行基線校準(zhǔn)，向其中一個(gè)比色皿中緩慢的通入CO氣體1 min，冰上放置反應(yīng)1 min后，在400～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得到還原型CYP55B1與CO形成復(fù)合物的紫外光譜.

1.4 細(xì)胞色素P450 55B1修飾熱裂解石墨電極的制備

麂皮材料上添加少量0.05 μm的氧化鋁粉末，用二次蒸餾水浸潤(rùn)，熱解石墨電極(PGE，直徑3 mm)于麂皮材料上順時(shí)針?lè)较驋伖猓瑹o(wú)水乙醇中超聲波清洗1次，二次蒸餾水中超聲清洗2次，每次3 min，室溫晾干，取10 μL修飾液[3 μL 2.5%戊二醛(GA)溶液、3 μL 2.5%牛血清白蛋白溶液(BSA)和4 μL CYP55B1蛋白樣品，混合均勻]滴涂在熱解石墨電極表面，4 ℃交聯(lián)固定過(guò)夜，得到CYP55B1修飾熱裂解石墨電極(CYP55B1/GA/BSA/PGE).不含有CYP55B1修飾熱裂解石墨電極(GA/BSA/PGE)作為對(duì)照.

1.5 CYP55B1/GA/BSA/PGE檢測(cè)NO

電解池中加入5 mL 0.1 mol·L-1的PBS溶液(pH7.0)，氮?dú)獬?0 min，保持氮?dú)夥?，將三支電極置于檢測(cè)池，不斷地加入NO溶液，磁力攪拌子混合均勻后，進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描檢測(cè)，掃速為0.5 V/s.

1.6 CYP55B1催化NO機(jī)理驗(yàn)證

向1.5中的溶液中不斷加入NO溶液，直至該催化反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)后，向反應(yīng)池中不斷地加入母液濃度為1.8 mmol·L-1的NADH溶液，磁力攪拌子混合均勻，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.

1.7 CYP55B1/GA/BSA/PGE的選擇性

將修飾電極放入裝有電解池中，加入5 mL 0.1 mol·L-1的PBS溶液(pH7.0)，通氮除氧20 min，分別加入不同濃度的干擾物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)、氯化銨(NH4Cl)、亞硝酸鈉(NaNO2)、L-精氨酸(L-Arg)、雙氧水(H2O2),采用循環(huán)伏安法(CV)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，掃速為0.5 V/s,重復(fù)試驗(yàn)3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白純化SDS-PAGE分析

對(duì)CYP55B1表達(dá)純化各步驟樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示：第1、2泳道是重組菌超聲破碎離心的沉淀和上清液；第3泳道為鎳柱流出液，可見(jiàn)待純化樣品與在鎳親和純化柱冰上孵育結(jié)合后，由于雜蛋白與填料結(jié)合不牢固，直接流出；第4～9泳道是咪唑的梯度洗脫液，少數(shù)雜蛋白被梯度濃度咪唑緩沖液洗脫下來(lái)，最后經(jīng)高濃度500 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫得到純度較高的目的蛋白，且其分子量大小48 kDa, 與理論預(yù)測(cè)的CYP55B1大小一致.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CYP55B1表達(dá)純化成功，可用于后續(xù)的傳感器的構(gòu)建.

M)Marker；1)誘導(dǎo)表達(dá)22 h重組菌破碎離心沉淀；2)誘導(dǎo)表達(dá)22 h 重組菌破碎離心上清液；3)流出液；4～9)50、100、150、200、250、500 mmol·L-1咪唑洗脫

2.2 CYP55B1的CO差示光譜測(cè)定

重組菌樣品破碎后4 ℃、10000 g離心20 min的上清液、沉淀以及500 mmol·L-1咪唑洗脫液的樣品進(jìn)行CO差示光譜測(cè)定，結(jié)果如圖2所示.測(cè)定各組分均具有P450特征性的紫外吸收峰，證明了CYP55B1成功誘導(dǎo)表達(dá)及純化，且純化后的蛋白樣品仍具有活性.代入公式[13]，計(jì)算得到純化后CYP55B1的濃度為0.075 nmol·L-1.

圖2 CYP55B1純化CO差示光譜

2.3 CYP55B1的直接電化學(xué)

在-1.2～0.1 V范圍內(nèi)，掃速為0.5 V/S，對(duì)CYP55B1修飾熱裂解石墨電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.如圖3所示：不含CYP55B1修飾熱裂解石墨電極(GA/BSA/PGE)，在掃描范圍內(nèi)，無(wú)任何氧化還原峰；而 CYP55B1修飾熱裂解石墨電極(GA/BSA/CYP55B1/PGE)，有一對(duì)峰形較好的氧化還原電流峰，其氧化峰電位位于-0.355 V，還原峰電位位于-0.385V，氧化還原峰電位差值ΔEp為30 mV.結(jié)果表明：CYP55B1在熱裂解石墨電極表面實(shí)現(xiàn)了直接電化學(xué)，其活性中心的卟啉鐵與電極之間實(shí)現(xiàn)了直接電子傳遞，電位高于-0.355 V,卟啉鐵為+3價(jià)的氧化態(tài)，電位低于-0.385 V，卟啉鐵為+2價(jià)的還原態(tài).

圖3 GA/BSA/PGE和GA/BSA/CYP55B1/PGE的循環(huán)伏安圖

考察測(cè)定液pH值對(duì)CYP55B1直接電化學(xué)的影響，將修飾電極GA/BSA/CYP55B1/PGE置于不同pH值的0.1 mol·L-1PBS溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果如圖3a所示.CYP55B1特征還原峰峰電位隨著緩沖溶液pH值的改變而發(fā)生一定程度的遷移，由此得到圖4b，即還原峰電位與緩沖液pH值的關(guān)系圖，還原峰電位與緩沖液pH值成反比關(guān)系，緩沖液的pH值越高，還原峰電位越低.

圖4 GA/BSA/CYP55B1/PGE在不同pH值的循環(huán)伏安曲圖(a)CYP55B1還原峰電勢(shì)與pH值線性關(guān)系圖(b)

2.4 CYP55B1催化還原NO

CYP55B1修飾熱裂解石墨電極放入PBS溶液，得到了其活性中心卟啉鐵的氧化還原峰峰.不斷地向測(cè)定池中加入NO溶液，磁力攪拌混合均勻后進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果如圖5所示：隨著NO的不斷加入，-0.85 V處的還原峰電流在不斷升高，同時(shí)伴隨-0.35 V處還原峰電流不斷降低，加入NO到一定濃度后，-0.85 V處的還原峰電流和-0.35 V處還原峰電流不再發(fā)生變化(2～11).NO與CYP55B1活性中心的卟啉鐵的鐵離子結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物從電極得到一個(gè)電子，發(fā)生還原，還原峰電位位于-0.85 V，同時(shí)由于卟啉鐵的自由鐵離子減少，-0.35 V處還原峰電流不斷降低.由于固定于電極表面的細(xì)胞色素P450 55B1的量一定，所以加入一定濃度NO后，CYP55B1與NO的結(jié)合達(dá)到飽和，-0.85 V處的還原峰電流和-0.35 V處還原峰電流不再發(fā)生變化.

1～11：NO濃度分別為0、3.6、10.8、18、25.2、32.4、39.6、46.8、54、61.2、68.4 μmol·L-1

如圖6所示，NO的濃度在14.4～108 μmol·L-1范圍內(nèi)，還原峰電流增大值與加入NO的濃度之間呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.01696x-0.03447(R2=0.9766)，檢測(cè)限(LOD)為10.47 μmol·L-1.

圖6 不同濃度NO與復(fù)合物電流差值的線性關(guān)系圖

2.5 CYP55B1/GA/BSA/PGE催化NO機(jī)理驗(yàn)證

CYP55B1修飾熱裂解石墨電極放入PBS溶液，不斷地向反應(yīng)池中加入NO溶液，直至-0.85 V與-0.35 V處峰電流不再發(fā)生變化(1)，此時(shí)CYP55B1與結(jié)合達(dá)到飽和，再依次向反應(yīng)池中加入母液濃度為1.8 mmol·L-1的NADH溶液，混合均勻后進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果如圖7所示：隨著溶液中NADH濃度不斷地增大，-0.35 V處還原峰電流在逐漸升高(2-11)，表明在NADH不斷提供電子的作用下，CYP55B1不斷催化與其結(jié)合的NO還原為N2O，N2O離開(kāi)CYP55B1的卟啉鐵，自由的卟啉鐵離子在電極表面發(fā)生還原，導(dǎo)致-0.35 V處還原峰電流的不斷升高，符合細(xì)胞色素P450 55B1催化NO的還原反應(yīng)機(jī)理.

1～11：NADH濃度分別為0、3.6、10.8、18、25.2、32.4、39.6、46.8、54、61.2、68.4 μmol·L-1

2.6 CYP55B1/GA/BSA/PGE的選擇性

選取谷胱甘肽、L-精氨酸、氯化銨、亞硝酸鈉及雙氧水5種物質(zhì)來(lái)驗(yàn)證該檢測(cè)方法的選擇性.這幾種物質(zhì)在生物體內(nèi)存在較普遍，在檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)可能會(huì)以干擾物質(zhì)的形式存在，且谷胱甘肽和L-精氨酸可作為生物體合成NO的底物.在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，加入干擾物質(zhì)的濃度與NO的濃度相同，混合均勻后進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，重復(fù)3次.為了便于分析，選取NO、亞硝酸鈉、雙氧水、L-精氨酸、谷胱甘肽、氯化銨的濃度分別為18、36、54、72 μmol·L-1時(shí)-0.85 V處還原峰電流增加值進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖8所示.由圖可知：濃度為18 μmol·L-1時(shí)，其它物質(zhì)的峰電流增加值均較低，相較之下，NO對(duì)應(yīng)的峰電流增加值較大.濃度為36 μ mol·L-1時(shí)，谷胱甘肽、L-精氨酸、氯化銨的電流差值為負(fù)值，NO的峰電流持續(xù)增加了近一倍，且隨著濃度的不斷升高，峰電流在不斷地上升，而其他物質(zhì)對(duì)應(yīng)的電流值并不具有規(guī)律性的變化.該結(jié)果表明，CYP55B1能在電極表面催化NO，但對(duì)其他常見(jiàn)含氮物質(zhì)或強(qiáng)氧化物不具有催化活性，該檢測(cè)技術(shù)具有特異性.

圖8 CYP55B1-BSA-GA修飾熱解石墨電極的選擇性

3 結(jié)語(yǔ)

本研究將構(gòu)建成功的原核表達(dá)載體pET-28a-55b1通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，以β-半乳糖苷作為誘導(dǎo)劑，成功實(shí)現(xiàn)了CYP55B1的異源原核表達(dá).通過(guò)超聲破碎及鎳親和柱層析技術(shù)，對(duì)CYP55B1進(jìn)行提取和純化，最終得到了具有P450活性的CYP55B1.通過(guò)戊二醛和BSA共價(jià)交聯(lián)技術(shù)將CYP55B1蛋白固定于熱解石墨電極表面，利用CHI660電化學(xué)工作站，實(shí)現(xiàn)了NO的直接電化學(xué)檢測(cè)以及CYP55B1催化NO的機(jī)理驗(yàn)證，并探討了該檢測(cè)方法的特異性.結(jié)果表明：CYP55B1具有P450nor的特性，能夠催化NO的還原，且該催化反應(yīng)需要NADH的參與，CYP55B1及其催化形成的復(fù)合物均具有電化學(xué)信號(hào)，能夠?qū)崿F(xiàn)NO的直接電化學(xué)檢測(cè).本研究利用這一催化反應(yīng)機(jī)理，并基于酶促反應(yīng)具有專(zhuān)一性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了一種NO的檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)只對(duì)NO具有響應(yīng)，而對(duì)于一些在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生NO的前體物質(zhì)如谷胱甘肽不具有電化學(xué)響應(yīng).后續(xù)擬通過(guò)進(jìn)一步探究和改進(jìn)，有望將該檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際樣品的檢測(cè)，提高其實(shí)用性.