段陽芳 程曉雷 王玲 張強 危由春

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma. TSCC)是最常見的口腔頜面部腫瘤之一，侵襲力強，復發(fā)率高，雖然臨床上的診斷和治療手段不斷提高，但是病人的五年生存率仍舊很低[1-2]。因此探究背后的發(fā)病機制具有很高的臨床應用價值。端粒是真核細胞染色體線性末端特殊的結構，由端粒DNA和端粒相關蛋白組成，保護染色體末端結構的完整性，防止染色體末端被DNA損傷識別系統(tǒng)(DNA damage respond, DDR)識別而發(fā)生融合或重組[3]。端粒酶在維持端粒長度中起著十分關鍵的作用，端粒酶由端粒酶RNA成分TERC和端粒酶催化亞基TERT以及端粒酶相關蛋白組成。大量研究表明，在不同類型的腫瘤細胞中，端粒酶活性都異常高于正常細胞，敲低TERT或者TERC以及其他影響端粒酶活性的機制都有可能導致腫瘤細胞的增殖減慢，證明了端粒酶活性在維持腫瘤細胞過程的重要性[4-7]。RNA結合蛋白HuR是胚胎致死性視網(wǎng)膜異常(embryonic lethal abnormal vision, ELAV)家族中的重要成員，其廣泛表達于各種組織中，通過結合到RNA上，參與基因的轉錄后調(diào)控，包括調(diào)控RNA的剪切，加工，穩(wěn)定和翻譯等，進而調(diào)控細胞生長，炎癥反應，細胞衰老等生命過程。大部分的腫瘤細胞中HuR表現(xiàn)為異常高表達，通過調(diào)控不同的靶基因，從而影響腫瘤細胞的增殖，侵襲和耐藥性等。本文擬探究舌鱗癌細胞中端粒酶活性和HuR的表達水平以及之間的關系，并探索舌鱗癌發(fā)生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗對象 臨床手術癌及正常組織樣本(6 例)(南昌大學第一附屬醫(yī)院)；舌鱗癌細胞系SCC-25(ATCC。

1.1.2 主要試劑與儀器 丙烯酰胺膠(B1000)、 RIPA裂解液(C1053)(北京普利萊)； 蛋白酶抑制劑(L2500,Selleck,美國)； TRAP試劑盒(KGA414,南京凱基)； HuR抗體、 Tubulin抗體、 GAPDH抗體(11910-1-AP, 11224-1-AP,6004-1-Ig,Proteintech, 美國)； Flag抗體(F1804, Sigma, 美國)； 熒光二抗(A23910,A23920, 武漢亞科因)；PierceTM-Magnetic-RNA-Protein-Pull-Down-Kit(20164, Thermo, 美國)； Protein A/G(B23201, 上海biomake); TransZol、 反轉錄試劑盒(ET101-01)、 TransStart Top Green qPCR SuperMix(AQ101, 北京全式金生物)；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(11668030)、PCR儀(Thermo, 美國)；TaKaRa-genomic-extraction-Kit(9781S,TaKaRa, 日本)；Telo-TAGGG-telomere-Length-Assay(1220913600,Roch,美國)；Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LICOR,美國)熒光定量PCR儀器CFX96(BioRad,美國)。

1.2 方法

1.2.1 組織和細胞端粒酶活性檢測 組織樣本端粒酶提?。菏中g后取下的組織，立即保存在液氮之中。 40～100 mg冷凍的組織用無菌眼科剪盡量剪碎，用研磨器研磨，加入40 μl的NP-40 lysis buffer(10 mmol/L Tris pH8.0, 1 mmol/L Mgcl2, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl 1% NP40) (加入β-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑)，渦旋振蕩10 s, 置于冰上30 min，4 ℃，12 000 r/min, 20 min移取上清液，分裝速凍至液氮備用，其中一份用來定量，并調(diào)整到同一濃度。

細胞樣本端粒酶提?。菏占毎?，對細胞進行計數(shù)，取10 萬個細胞放入離心管中，3 000 r/min, 5 min，棄上清，加入50 μl NP-40 lysis buffer,至冰上置于冰上30 min，4 ℃，12 000 r/min, 20 min移取上清液，分裝速凍至液氮備用。

端粒重復序列擴增法(TRAP):每個樣品取2 μl加入48 μl的TRAP反應體系中，混勻，在PCR儀上進行如下反應，30 ℃，孵育30 min，94 ℃，5 min，之后進行25 個以下循環(huán)，94 ℃，30 s； 50 ℃，30 s； 72 ℃，30 s，最后72 ℃延伸5 min。反應產(chǎn)物取20 μl跑膠，用SYBR-Safe對凝膠進行染色，紫外燈下檢測。

1.2.2 蛋白免疫印跡(Western blot) 組織或細胞樣品，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清用BCA方法進行蛋白定量后加入Loading buffer，95 ℃煮10 min。在丙烯酰胺膠中上等量的蛋白量，電泳，轉膜，4 ℃孵育一抗，HuR(1∶1 000)，Tubulin(1∶5 000),GAPDH(1∶5 000),Flag(1∶1 000)，用TBST洗膜，洗3 次每次10 min，之后在室溫孵育相應的熒光二抗，1 h，用TBST洗膜，洗3 次每次10 min, 發(fā)光。

1.2.3 RNA-pulldown 實驗方法參照廠家說明書。簡要地說，用引物5′-CCAAGCTTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCT-3′和5′-GCTGTGTGAGCCGAGTCCTGG-3′對PCR擴增帶有T7啟動子的TERC作為標記探針的模板，0.5 mg的標記探針和250 μg的RIPA裂解細胞液室溫孵育30 min后，RNA-蛋白復合體用paramagnetic-streptavidin-conjugated-Dynabeads沉淀后Western blot檢測。

1.2.4 RNA免疫共沉淀實驗(RNA-IP) 細胞在紫外線(200 mJ/cm2)交聯(lián)后用IP buffer(50 mmol/L HEPES pH7.5, 150 mmol/L KCl, 2 mmol/L EDTA,1%NP-40)裂解后，500 μg的蛋白裂解液和2 μg的HuR抗體或者lgG抗體孵育，RNA-蛋白復合體用Protein A/G沉淀，IP wash buffer(50 mmol/L HEPES pH7.5, 300 mmol/L KCl, 1 mmol/L DTT, 1% NP-40)洗4 次，每次10 min。 RNP-IP 產(chǎn)物加Trizol 提取后，RT-PCR檢測。

1.2.5 逆轉錄實時熒光定量PCR反應 Trizol法提取的RNA定量后取1 μg進行逆轉錄反應。參照說明書配置qPCR mix, 引物對5′-TCTAACCCTAACTGAGA

AGGGCGTAG-3′和5′-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3′檢測TERC，引物對5′-GGGTGACATCGGGAGAACG-3′和5′-CTGAACAGGCTTCGTAACTCAT-3′檢測HuR，引物對5′-CTGGGCTACACTGAGCAC-3′和5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′ 檢測內(nèi)參GAPDH。

1.2.6 細胞培養(yǎng)和轉染 SCC25細胞購于中科院細胞中心，用DMEM加10%胎牛血清，雙抗，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱。轉染用Lipofectamine2000,按照試劑說明書進行操作，寡核苷酸5-AAGAGGCAATTACCAGTTTCA-3用于敲低HuR。通常情況下，敲低72 h收細胞檢測；過表達質粒48 h收細胞檢測。

1.2.7 端粒長度檢測 用試劑盒提取基因組后按照Telo TAGGG telomere Length Assay說明書進行檢測。簡要地，基因組首先用HilfI和Rsal限制性內(nèi)切酶消化，之后用0.8%瓊脂糖膠電泳，毛細管虹吸轉膜后，預雜交后用地高辛標記探針進行雜交，去掉雜交液后用wash buffer洗膜，室溫孵育抗地高辛的帶有堿性磷酸酶的二抗，最后，加入發(fā)光底物后暗室壓片曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(ANOVA)對數(shù)據(jù)進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 舌鱗癌中端粒酶活性及HuR表達水平增高

收集6 組臨床舌鱗癌組織及正常組織中，組織端粒酶活性分析結果顯示，癌組織中端粒酶活性明顯高于正常組織(P<0.001)(圖 1A 左：TRAP； 右：相對的端粒酶活性)。同樣地，組織Western Blot 結果表明在癌組織中HuR的表達水平也明顯增高，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖 1B 左:Western blot； 右：HuR的相對表達水平)。其中blank空白孔1N-6N為正常組織，1C-6C為癌組織。

圖 1 正常組織和癌組織中端粒酶活性及HuR表達水平

Fig 1 The level of telomerase activity and HuR in normal and carcinoma tisssues

2.2 HuR能夠和端粒酶RNA TERC 結合

RNA-pulldown結果顯示，端粒酶RNA TERC的A片段能夠結合HuR(圖 2A, P16-CR為陰性對照，P16-3UTR為陽性對照)。同樣，RNA免疫沉淀實驗顯示，相比lgG，HuR能夠明顯富集TERC(P<0.001)(圖 2B, 上: RNA-IP結果；下：鑒定IP的效果)。以上結果表明，HuR能夠和端粒酶RNA TERC結合。

圖 2 HuR與端粒酶TERC的結合情況

2.3 HuR影響端粒酶的組裝

在穩(wěn)定表達Flag-TERT的舌鱗癌細胞系SCC25細胞中敲低HuR，Western blot 結果顯示，F(xiàn)lag-TERT的蛋白水平不受影響(圖 3A)，同樣qPCR結果顯示，TERC的水平也沒有改變(圖 3B)。然而，在敲低HuR的細胞中，RNA-pulldown實驗顯示，結合到TERC上的HuR和Flag-TERT明顯減少(圖 3C)。同時，敲低HuR后，TRAP結果顯示，端粒酶活性也明顯降低(圖 3D)。

圖 3 敲低HuR對SCC25細胞端粒酶的影響

以上結果表明，HuR可能是通過影響TERC和Flag-TERT的結合，進而影響端粒酶的活性。

2.4 長期敲低HuR使舌鱗癌細胞端?？s短

分別收集敲低HuR 3 d，30 d和60 d的SCC25細胞，western blot結果顯示敲低效果顯著，TRAP檢測每個時間點實驗組的端粒酶活性均降低(圖 4A)。細胞提取基因組后用Southern Blot 檢測其端粒長度，結果顯示，與對照細胞相比，實驗組端粒明顯縮短，且具有時間依賴性(圖4B)。

圖 4 敲低HuR對SCC25細胞端粒長度的影響

Fig 4 The effect of HuR knockdown on telomere length in SCC25 cells

3 討 論

端粒酶是一個復雜的RNA核糖核蛋白體，其核心成分由端粒酶RNA TERC,端粒酶催化亞基TERT和DKC1組成。端粒酶在細胞核內(nèi)卡哈爾體(cajal body)中組裝成熟，并轉移到端粒末端，在端粒相關蛋白的幫助下打開端粒并進行延伸反應[8]。其中任何一個環(huán)節(jié)對于端粒的延伸都至關重要。正常體細胞端粒酶活性極低，端粒長度隨分裂逐漸縮短，干細胞，精細胞和約85%的腫瘤細胞中均可檢測出很高的端粒酶活性[9]，這就為腫瘤的診斷和治療手段提供了新的靶點。

研究表明，正常的口腔黏膜組織中端粒酶活性很低，而癌前病變，癌組織中端粒酶活性明顯增高，且活性高低與腫瘤的分化程度和腫瘤的預后呈負相關[10-12]，因此端粒酶活性可以作為區(qū)分口腔惡性腫瘤與良性腫瘤或者正常黏膜組織的標志。大部分腫瘤細胞中存在端粒酶催化亞基TERT啟動子區(qū)突變導致其異常表達，是腫瘤細胞端粒酶活性增高的機制[13-14]。有研究報道，頭頸部鱗狀細胞癌中TERT啟動子區(qū)突變率約為17%，而起源于舌的鱗癌更高[14]。在口腔鱗狀細胞癌中，TERT啟動區(qū)甲基化狀態(tài)的變化可能是促進TERT水平的表達增高的原因之一[15]。并且，TERT的表達水平高低也和臨床疾病的侵襲性密切相關[16]。盡管TERT的異常表達被認為是調(diào)控口腔腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，但是作為端粒延伸模板的TERC同樣不可或缺。近些年多篇文獻報道，口腔鱗狀細胞癌中TERC水平明顯增高，TERC的轉錄增加與腫瘤的惡性程度呈正相關[17-19]。在口腔癌細胞中RNA結合蛋白脆性X染色體相關蛋白1(FXR1)能夠結合到端粒酶TERC上，保護其不被降解，從而避免了P53介導的細胞衰老[20]。以上研究表明端粒酶TERC在口腔腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中也起到很重要的作用。

本文從端粒酶TERC入手，發(fā)現(xiàn)另一種在口腔腫瘤細胞中高表達的RNA結合蛋白HuR能夠結合到TERC上，使其與端粒酶催化亞基TERT的結合增加，促進了端粒酶的成熟，進而從另一方面補充了口腔腫瘤細胞中端粒酶活性的增高的機制。在SCC25細胞中長期敲低HuR，端粒酶活性降低，而端粒長度明顯縮短，說明了HuR在OTSC中端粒酶活性調(diào)控的重要性。既往研究表明，HuR通過結合到靶基因的3'非翻譯區(qū)，對其剪切加工，穩(wěn)定性和翻譯效率進行調(diào)控。但也有文獻報道，HuR能夠結合到c-myc基因上從而影響其與microRNA let-7的結合，提示HuR或許能夠影響靶基因RNA的結構[21]。因此本研究推測HuR有可能促進TERC結構的折疊從而使得TERT與TERC的結合增強，但是其具體的機制還有待深入探究。