馬秀麗

摘 ?要：根據(jù)DHBV的C基因參考序列設(shè)計(jì)一對特異性引物建立PCR檢測方法。建立的PCR方法只能特異地檢出DHBV，該方法最低檢出模板量為146pg。用建立的PCR方法對2015～2018年不同地區(qū)的櫻桃谷鴨血清進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同鴨群中乙型肝炎的感染率差異較大，沒有明顯的時(shí)空分布規(guī)律。對2019年不同日齡和品種的鴨進(jìn)行采樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)櫻桃谷肉鴨和麻鴨的自然感染率均較高，但不同日齡之間無明顯規(guī)律。種鴨的自然感染率較低，且隨著日齡的增大，感染率略有升高。鵝也可以感染鴨乙型肝炎病毒。

關(guān)鍵詞：鴨乙型肝炎病毒;流行病學(xué)

中圖分類號：S858.321：31+3 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2020）4-0048-04

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的一個(gè)主要公共衛(wèi)生問題。由于HBV宿主范圍狹窄，有明顯嗜肝性和種屬特異性，建立較理想的HBV感染細(xì)胞及動(dòng)物模型都很困難，成為限制抗HBV藥物開發(fā)和評價(jià)的主要障礙[1]。鴨乙型肝炎病毒（DHBV）與HBV同屬嗜肝DNA病毒科，兩者在形態(tài)結(jié)構(gòu)、核酸組成、生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)理和相對嗜肝性等方面有眾多相似之處，而鴨對DHBV易感，且價(jià)格低廉，易于飼養(yǎng)，因此鴨乙型肝炎模型被用作抗HBV藥物篩選及HBV致病機(jī)理研究的理想動(dòng)物模型[2-3]。因此，需要建立相應(yīng)的快速檢測方法對模型動(dòng)物中DHBV感染情況進(jìn)行分析，為今后開展有效的藥物評價(jià)奠定良好基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?DHBV參考毒株（WS株） ?鄭州大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 ?臨床樣品 ?由山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采集保存。

1.3 ?鴨乙型肝炎病毒PCR檢測方法的建立

1.3.1 ?引物設(shè)計(jì)合成 ?根據(jù)Genbank中登錄的DHBV的C基因參考序列設(shè)計(jì)合成一對特異性引物：

DHBV-C上游：

5'-CAGGGAGGCAGAAAAACAT-3';

DHBV-C下游：

5'-TTCCTAGGCGAGGGAGATC-3'，擴(kuò)增片段大小為197bp。

1.3.2 ?PCR擴(kuò)增 ?常規(guī)方法提取WS毒株的DNA模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.3 ?PCR方法的特異性和敏感性 ?常規(guī)方法提取DHBV、DHAV-1、DHAV-3、DPV、鴨源E. coli、鴨源NDV、鴨源AIV-H9和RA等病原的模板，用建立的PCR方法檢測檢驗(yàn)該P(yáng)CR方法的特異性。將DHBV參考毒株WS株提取DNA，測定其濃度，并作10倍梯度稀釋，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測該P(yáng)CR方法的敏感性。

1.4 ?鴨乙型肝炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查 ?收集不同時(shí)期不同地區(qū)的櫻桃谷鴨血清，用建立的PCR方法進(jìn)行檢測，分析鴨乙型肝炎病毒的自然感染情況。同時(shí)對不同時(shí)間、不同地方、不同品種和不同日齡的鴨血清進(jìn)行檢測，分析鴨乙型肝炎病毒的感染情況。選取適量的雞、鴿和鵝血清，檢測鴨乙型肝炎病毒的感染情況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?PCR方法的特異性和敏感性 ?用建立的PCR方法只能特異性檢出DHBV（擴(kuò)增片段大小為197bp），而不能檢出DHAV-1、DHAV-3、DPV、鴨源E.coli、鴨源NDV、鴨源AIV-H9和RA等其它病原，見圖1。DHBV WS株DNA（1460ng）作10-4稀釋后仍能擴(kuò)出目的條帶，表明該方法最低檢出量為146pg，見圖2。

2.2 ?鴨乙型肝炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查 ?用建立的PCR方法對2015～2018年不同地區(qū)的75份櫻桃谷鴨血清進(jìn)行檢測，結(jié)果鴨乙型肝炎陽性率高達(dá)25.33%，但不同時(shí)期不同地區(qū)鴨乙型肝炎的感染沒有規(guī)律性，相同年份不同地區(qū)的感染程度差異也較大，有些為0感染，有些為100%感染。這可能與采集樣品數(shù)量偏少有關(guān)。2019年采集了不同地區(qū)的櫻桃谷鴨、麻鴨和種鴨血清，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)櫻桃谷鴨和麻鴨中鴨乙型肝炎的感染率均較高。而種鴨的感染率較低，日齡大的種鴨群感染率略高于日齡小的種鴨群。雞、鴿的檢出率均為0%，而部分鵝場的檢出率可高達(dá)20%。結(jié)果詳見表1、表2、表3。

3 ?討論

鴨乙型肝炎對鴨群的危害往往呈隱性感染，自然感染鴨不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，該病的病原分離也比較困難，因此，迫切需要建立快速的檢測方法進(jìn)行確診。本研究根據(jù)DHBV的C基因設(shè)計(jì)一對特異性引物，建立的PCR方法特異性好，敏感性高，最低模板檢出量為146pg。與已有報(bào)道相符合[4]。

鴨乙型肝炎感染雛鴨試驗(yàn)是目前評價(jià)抗HBV藥物理想的動(dòng)物模型，試驗(yàn)之前需對鴨群的健康背景作全面了解。因此本試驗(yàn)利用建立的PCR方法對2015～2018年不同地區(qū)采集的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同鴨群中乙型肝炎的感染率差異較大，沒有明顯的時(shí)空分布規(guī)律。其它家禽品種如雞、鴿中未檢測到鴨乙型肝炎病毒的感染，而鵝可以感染鴨乙型肝炎病毒，應(yīng)引起養(yǎng)殖戶的重視。

為進(jìn)一步探討鴨乙型肝炎自然感染率與品種和日齡的關(guān)系，本研究對2019年不同日齡和品種的鴨進(jìn)行采樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉鴨和麻鴨的自然感染率均較高，有些甚至達(dá)到100%，但不同日齡之間無明顯規(guī)律。種鴨的自然感染率較低，這可能與種鴨場生物安全制度落實(shí)到位有關(guān)。但隨著日齡的增大，種鴨感染率略有升高。

綜合上述檢測結(jié)果，目前鴨乙型肝炎的自然感染已很普遍[5]，所以在選擇鴨群作為動(dòng)物感染模型時(shí)，優(yōu)先選用SPF鴨，但因國內(nèi)SPF鴨數(shù)量有限，所以動(dòng)物感染試驗(yàn)前應(yīng)對鴨群進(jìn)行逐一排查，才能保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。本研究建立的PCR方法可為鴨乙型肝炎的普查和人乙型肝炎藥物的評價(jià)提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?周翊鐘，寇平原，邵龍琪.一種可能與鴨肝炎和肝癌相關(guān)的病毒[J].上海醫(yī)學(xué)，1980，3（11）：1-3。

[2] ?ZUCKERMAN A J.Screening of antibiral drugs for hepadna virus infection in Peking ducks：a review[J].J Virol Methods，1987，17（1）：119-126.

[3] ?W.S. Mason， G. Seal， J. Summers， Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis B virus[J]. J Virol，1980（36）：829-836.

[4] ?高駿，孫鳳萍，魏曉峰，等，鴨乙型肝炎病毒PCR診斷方法的建立及應(yīng)用[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（6）：4-6。

[5] ?楊曉雪，王玉，王敬諭，等，鴨乙型肝炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查與全基因組序列分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2018，38（10）：1878-1882。

Abstract：Polymerase chain reaction （PCR） with good specificity and high sensitivity was developed to quantification of DHBV DNA.146pg DNA of DHBV were detected by the method. There were different infection rate and no obviously spatial and temporal distribution of the sera from different areas in 2015～2018.The results showed that the infection rate of cherry valley ducks and shelducks was higher，but no changing regulation with variant age.While the infection rate of breeding duck is the lowest and there was a growing trend with age increasing in breeding ducks.Duck hepatitis B virus was existed in some goose.

Key words：duck hepatitis B virus;epidemiology