李濤，譚璐*，徐文泱，楊滔，王芳斌

1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長沙 410111）；2. 長沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院（長沙 410004）

水產(chǎn)品具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富、易消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)動物蛋白食物來源，深受人們喜愛。漁業(yè)環(huán)境污染和藥物的濫用嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的質(zhì)量和食品安全。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是以大環(huán)內(nèi)酯為母核，與分子糖通過糖苷鍵連接的一類抗生素[1]，對革蘭氏陽性菌及支原體有較強(qiáng)的抗菌活性[2-3]。四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類光譜抗生素，具有共同多環(huán)并四苯羧基酰胺的衍生物，能夠抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌感染疾病的治療[4-5]。大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素在畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中廣泛使用，在生態(tài)環(huán)境大量殘留，會導(dǎo)致水產(chǎn)品中抗生素殘留，通過食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重影響人類健康[6-8]。為保障食品安全，農(nóng)業(yè)部對水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素限量值進(jìn)行了規(guī)定[9]。目前，大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類的檢測方法主要有液相色譜法[10-11]、液相色譜質(zhì)譜法[12-14]、微生物法[15]、電化學(xué)法[16-17]等。微生物法存在特異性差，難以準(zhǔn)確定性定量等缺點(diǎn)；高效液相色譜對于獸殘檢出種類有較大局限性；液相色譜質(zhì)譜法較為普遍。

四極桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜（Q Exactive Focus）是近年來發(fā)展起來的新式的質(zhì)譜，具有高分辨率和高質(zhì)量精度的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)常規(guī)質(zhì)量測定，能實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)的區(qū)別鑒定以及未知物的確證，現(xiàn)已在農(nóng)藥殘留分析[18]、獸藥殘留分析[19]和保健食品非法添加[20]等領(lǐng)域應(yīng)用。試驗(yàn)利用四極桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，建立了水產(chǎn)品中7種大環(huán)內(nèi)酯類和5種四環(huán)素抗生素化合物的快速篩查方法，使用精確質(zhì)量數(shù)及其二級質(zhì)譜定性，大幅提升定性準(zhǔn)確性，降低基質(zhì)干擾影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Q Exactive Focus液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific）；Hypersil Gold 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm，美國Thermo Fisher Scientific）。

生鮮草魚（市售）。乙腈（色譜純，上海安譜）；甲醇（色譜純，上海安譜）；甲酸（色譜純，上海國藥）；乙酸銨（分析純，上海國藥）；泰樂菌素、替米考星、羅紅霉素、克拉霉素、紅霉素、林可霉素、米諾環(huán)素、美他環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr公司）；交沙霉素、差向四環(huán)素（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 樣品的制備

樣品取可食用部分混勻，精密稱取2.0 g混勻后樣品，置于50 mL離心管中，加入25.0 mL 80%乙腈0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine溶液，振蕩搖勻處理30 min，冷凍離心，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測定。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相A，0.1%甲酸水溶液；流動相B，乙腈；采用梯度洗脫模式進(jìn)樣，梯度洗脫程序詳見表1；流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.4 質(zhì)譜條件

離子源HESI，毛細(xì)管電壓3 000 V，掃描模式PRM/Targeted-MS2，掃描范圍m/z100～950，分辨率（R）35 000；電噴霧離子源溫度320 ℃，氣化溫度350 ℃，鞘氣壓（N2）40 arb，輔助氣壓（N2）15 arb，離子傳輸管溫度320 ℃，噴霧電壓4.0 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

在相同流動相、梯度洗脫程序及相同色譜條件下，分別選擇Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）、Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）和Hypersil Gold C8色譜柱色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）對12種抗生素化合物進(jìn)行色譜分離。結(jié)果顯示，3種色譜柱對大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素能進(jìn)行有效分離，其中Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）分離效果最優(yōu)，因此采用Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）。

2.1.2 流動相的選擇

在相同的洗脫程序和相同色譜柱下，無機(jī)流動相分別選擇水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙酸銨（5 mmol/L），有機(jī)流動相選擇乙腈考察分離效果。結(jié)果顯示，水溶液-乙腈分離峰形較差，0.1%甲酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸乙酸銨（5 mmol/L）-乙腈流動相均對12種抗生素分離效果良好，流動相中加入0.1%甲酸可顯著提高目標(biāo)物電離效果，提高質(zhì)譜響應(yīng)，乙酸銨未明顯改善目標(biāo)化合物的分離與質(zhì)譜響應(yīng)，為減少乙酸銨離子對于質(zhì)譜的污染，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈流動相體系。通過優(yōu)化試驗(yàn)，確定采用梯度洗脫程序。圖1為12種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取定量色譜圖，顯示化合物之間得到有效分離。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中12種抗生素化合物定量離子色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

依據(jù)目標(biāo)物化學(xué)分子量，在四極桿質(zhì)量分析器的分析窗口，進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析，得到目標(biāo)物母離子信息，再分別設(shè)置低、中、高碰撞電壓，檢測碎片離子。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)質(zhì)譜，得到目標(biāo)化合物的母離子參數(shù)，在母離子參數(shù)基礎(chǔ)上，設(shè)置碰撞電壓，軌道阱自動檢測子離子，12種抗生素質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 12種化合物的離子選擇參數(shù)表

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

分別精密稱取空白草魚，按樣品制備方法制備基質(zhì)提取液，以基質(zhì)提取液為稀釋液，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為2.0，5.0，10.0，15.0，20.0和50.0 ng/mL，以峰面積的響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X（ng/mL）為橫坐標(biāo)，外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白草魚樣品添加低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品制備方式處理，進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，以3倍和10倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限。12種抗生素的線性范圍、檢出限和定量限見表3。12種大環(huán)內(nèi)酯藥物在2.0～50 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸系數(shù)均在0.996以上，7種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出限在0.073～2.4 μg/kg之間，低于SN/T 1777.2—2007的規(guī)定（檢出限20 μg/kg），5種四環(huán)素類抗生素的檢出限在1.9～17 μg/kg之間，低于GB/T 21317—2007的規(guī)定（檢出限50 μg/kg）；定量限在0.24～50 μg/kg之間。

表3 12種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

在空白草魚樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)后樣品濃度分別為10.0，20.0和100.0 μg/kg，每個濃度樣品制備6份，測定12種抗生素的濃度，計(jì)算回收率和RSD值。由表4可知，當(dāng)加標(biāo)濃度為10.0 μg/kg時，回收率為83.1%～94.0%，精密度RSD為3.2%～5.6%；當(dāng)加標(biāo)濃度為20.0 μg/kg時，回收率為86.1%～95.7%，精密度RSD為1.6%～4.8%；當(dāng)加標(biāo)濃度為100.0 μg/kg時，回收率為88.2%～94.5%，精密度RSD為0.8%～3.8%。

表4 12種化合物的回收率和精密度

2.5 實(shí)際樣品的檢測

應(yīng)用此次試驗(yàn)所建立的檢驗(yàn)方法對市場采購的15個鮮活水產(chǎn)品進(jìn)行檢測，采用保留時間進(jìn)行定性，結(jié)合離子豐度比和二級特征離子進(jìn)行確證，均未檢出陽性樣品。

3 討論與結(jié)論

UPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜具有高分辨率和高質(zhì)量精度的特點(diǎn)，可用于高通量篩查，同時也可含量測定。此次試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中12種抗生素，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法簡單高效、靈敏度高，為水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素檢測提供方法參考，也對現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)檢測大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素具有有力補(bǔ)充。