石艷賓*，鮑佳彤，王亦萱，李文靜

1. 天津天獅學院（天津 301700）；2. 天津嘉匯捷瑞醫(yī)藥科技有限公司（天津 301800）

金銀花為忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾，主要功效成分有綠原酸、黃酮、揮發(fā)性油、木樨草苷等[1-2]。金銀花在中國具備悠長的保健歷史與藥用歷史，是藥食兩用植物，具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌消炎、降血壓、延緩衰老、保肝利膽、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高免疫力等藥理作用[3]。Sato等[4]、李文娜等[5]指出杜仲葉綠原酸類物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，能有效清除二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）、超氧陰離子自由基、羥自由基（·OH）、烷基自由基，對缺血再灌注損傷細胞具有明顯的保護作用。槲皮素、蘆丁是典型黃酮類物質(zhì)，能有效清除脂質(zhì)自由基、·OH、超氧陰離子自由基等，具備提高免疫力、抗衰老、降血糖血脂、抗心律失常、抗癌、殺菌等生理活性[6-7]。擺玉芬等[8]、周偉婧等[9]分析了番茄紅素與葡萄籽油、VE、原花青素及荔枝皮原花青素與VC、VE間協(xié)同抗氧化研究，研究表明在增加濃度的條件下復合抗氧化劑比單一組分的總活性的抗氧化能力強，主要是由于抗氧化成分之間常具備抗氧化協(xié)同的特征。黃酮與多酚類物質(zhì)、黃酮類化合物間具有協(xié)同抗氧化性[10-11]，以DPPH自由基清除能力為抗氧化能力的衡量指標，分析槲皮素、蘆丁對金銀花綠原酸提取物的抗氧化增效作用，為酚類物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)復配抗氧化劑開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸、蘆丁、槲皮素（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定研究院）；DPPH：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；VC、無水乙醇、甲醇（分析純，天津市匯杭化工科技有限公司）；金銀花（湖北明騰生物科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

UV1000紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；KQ-200VDV超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5K-Ⅲ低速離心機（長沙東旺實驗儀器有限公司）；ME204E分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；PL403電子天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花中綠原酸的提取工藝

1) 金銀花綠原酸的提取。稱取20 g金銀花粉末于錐形瓶中，按料液比1∶20（g/mL）加入70%乙醇溶液，在超聲功率200 W、溫度60 ℃下超聲提取25 min。將綠原酸超聲提取液冷卻至室溫后，在5 000 r/min下離心20 min，取其上清液于棕色試劑瓶中，冷藏備用。

2) 綠原酸含量的測定。配制質(zhì)量濃度為120 μg/mL綠原酸標準溶液，分別移取0，1，2，3，4，5和6 mL于25 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，制成綠原酸標準待測溶液。以零管為空白參照，在波長328 nm處測定系列標準溶液吸光度。以綠原酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制綠原酸標準曲線，得到線性回歸方程和相關系數(shù)R2值，并以此為依據(jù)計算金銀花綠原酸提取液的濃度。

1.3.2 清除DPPH自由基能力的測定

將按照1.3.1小節(jié)提取得到的金銀花綠原酸提取溶液、槲皮素溶液和蘆丁溶液，配制成一系列適宜濃度梯度的樣品溶液。取0.3 mL待測樣品溶液、0.6 mL 0.06 mol/L DPPH溶液，混合混勻，靜置反應30 min后，在515 nm處測定系列樣品溶液的吸光度，作為系列樣品溶液反應后Ar；在0.3 mL待測樣品溶液、0.6 mL 70%乙醇溶液反應后，測定樣品底液Ax；在0.3 mL乙醇溶液、0.6 mL 0.06 mol/L DPPH溶液反應后，得到空白對照Ac[12]。根據(jù)式（1）計算金銀花綠原酸提取溶液、槲皮素溶液、蘆丁溶液的DPPH自由基清除率SR值。依據(jù)金銀花綠原酸、槲皮素、蘆丁系列濃度樣品溶液SR，繪制樣品溶液濃度-DPPH自由基清除率曲線，計算半數(shù)清除率IC50值。

1.3.3 綠原酸與蘆丁、槲皮素復配SR值的測定

將金銀花綠原酸提取液分別與蘆丁、槲皮素按體積比1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1的比例復配，按照1.3.2小節(jié)測定復配后混合液DPPH自由基清除率，計算復配溶液的試驗半數(shù)清除率IC50mix。依據(jù)式（2）計算復配溶液理論半數(shù)清除率IC50add，分析蘆丁、槲皮素對金銀花綠原酸提取溶液的抗氧化增效作用。采用t檢驗法比較分析復配溶液的IC50add和IC50mix，確定是否有顯著性差異。若復配溶液試驗半數(shù)清除率IC50mix＜理論清除率IC50add值，表示兩者間有協(xié)同作用[9,13]。

式中：P1為金銀花綠原酸在復配組中占的比例；P2為蘆丁或槲皮素在復配組中占的比例，P2=1-P1；R為綠原酸與蘆丁或槲皮素單獨作用時的效價比，即R=IC50A/IC50B。

1.3.4 綠原酸、蘆丁、槲皮素之間清除DPPH自由基能力的測定

參考金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素DPPH自由基清除能力，制備質(zhì)量濃度為25 μg/mL三種樣品溶液。將金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素三者按體積比1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3比例混合均勻，依據(jù)1.3.2小節(jié)測定三者復配混合液的DPPH自由基清除率，應用抗氧化協(xié)同系數(shù)SE值（復合溶液測定的清除率（ESC）和理論清除率（TSC）之間的比值）分析三者間的協(xié)同抗氧化作用。根據(jù)式（3）計算復配溶液TSC值，計算不同復配組合下的抗氧化協(xié)同系數(shù)SE。

式中：ESC1、ESC2、ESC3分別為復合溶液中綠原酸、蘆丁、槲皮素的試驗清除率。

若抗氧化協(xié)同系數(shù)SE＜1，則表示綠原酸提取物與蘆丁、槲皮素間沒有明顯的協(xié)同作用；若SE＞1，則表示綠原酸提取物與蘆丁、槲皮素間具有協(xié)同作用。

2 結果與分析

2.1 金銀花綠原酸提取液制備

以綠原酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出綠原酸標準曲線，詳見圖1。線性回歸方程為y=0.049 21x-0.015 7，R2=0.999 0。依據(jù)1.3.1小節(jié)測定金銀花綠原酸提取液中綠原酸的濃度，為2.319 2 mg/mL。

圖1 綠原酸標準曲線圖

2.2 金銀花綠原酸清除DPPH自由基能力分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，將金銀花綠原酸提取液、蘆丁、槲皮素配制質(zhì)量濃度依次為5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL的樣品溶液，計算出金銀花綠原酸提取液、蘆丁、槲皮素、VC系列樣品溶液SR值、回歸方程、IC50值、R2值，詳見圖2、表1和表2。由圖2可知，4種樣品溶液對DPPH自由基均有較強的清除作用，且其清除能力隨著樣品濃度的增大而增強，但達到一定濃度后，清除DPPH自由基的能力增長緩慢。由表1可知，金銀花綠原酸對清除DPPH自由基的作用強于蘆丁、VC，弱于槲皮素，說明金銀花綠原酸具有較強的抗氧化能力。

2.3 綠原酸與蘆丁、槲皮素協(xié)同抗氧化作用研究

2.3.1 金銀花綠原酸與蘆丁協(xié)同清除DPPH自由基能力分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，測定金銀花綠原酸提取液和蘆丁溶液按比例1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1復配時的DPPH自由基清除率，并計算復配溶液IC50add，分析金銀花綠原酸與蘆丁協(xié)同清除DPPH自由基能力。由圖3可知，綠原酸、蘆丁復配溶液的試驗半數(shù)清除率IC50mix＜理論清除率IC50add，表明兩者間具有協(xié)同抗氧化作用。對比表2不同復配比例金銀花綠原酸、蘆丁混合液的IC50值，當復配比例為9∶1時，DPPH自由基半數(shù)清除率為27.97%，協(xié)同清除DPPH自由基的效果較好。

2.3.2 金銀花綠原酸與槲皮素協(xié)同清除DPPH自由基能力分析

圖2 綠原酸、蘆丁、槲皮素、VC清除DPPH自由基能力

表1 綠原酸、蘆丁、槲皮素、VC回歸方程與半數(shù)清除率

表2 綠原酸與蘆丁復配溶液抗氧化性回歸方程與半數(shù)清除率

圖3 綠原酸與蘆丁復配混合液協(xié)同抗氧化分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，測定金銀花綠原酸提取液和槲皮素溶液按比例1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1復配時的DPPH自由基清除率，并計算復配溶液IC50add，分析金銀花綠原酸與槲皮素協(xié)同清除DPPH自由基能力。由圖4可知，綠原酸、槲皮素復配溶液的試驗半數(shù)清除率IC50mix＜理論清除率IC50add，表明兩者間具有協(xié)同抗氧化作用。對比表3不同比例金銀花綠原酸、槲皮素混合液的IC50值，當復配比例為1∶9時，DPPH自由基半數(shù)清除率為17.76%，協(xié)同清除DPPH自由基的效果較好。

圖4 綠原酸與槲皮素復配溶液抗氧化能力分析

表3 金銀花綠原酸與槲皮素不同復配比例回歸方程與半數(shù)清除率

2.3.3 綠原酸、蘆丁、槲皮素協(xié)同清除DPPH自由基能力分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，測定金銀花綠原酸提取液、蘆丁、槲皮素溶液比例1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3復配時的DPPH自由基清除率，分析蘆丁、槲皮素對金銀花綠原酸抗氧化性的協(xié)同作用。由圖5可知，當金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素復配比例為1∶3∶3時，SE值為1.20，三者間協(xié)同清除DPPH自由基的效果較好。

圖5 槲皮素、蘆丁、綠原酸混合液抗氧化能力分析

3 結論

采用超聲波輔助提取金銀花中的綠原酸，分析蘆丁、槲皮素對金銀花綠原酸抗氧化增效作用。金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素清除DPPH自由基能力隨著抗氧化物質(zhì)濃度的增加而增大，其IC50值分別為33.80%，45.38%和26.77%。通過對比3種抗氧化劑的IC50值可知，對DPPH自由基的清除能力大小依次為：金銀花綠原酸抗氧化效果強于蘆丁，弱于槲皮素。將金銀花綠原酸分別于蘆丁、槲皮素按不同比例進行復配，結果發(fā)現(xiàn)蘆丁、槲皮素對綠原酸的抗氧化能力具有協(xié)同增效作用。當綠原酸與蘆丁復配比例為9∶1時，復配混合液的IC50值為27.97%；當綠原酸與槲皮素復配比例為1∶9時，復配混合液的IC50值為25.99%，清除DPPH自由基的能力最強。將金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素按固定比例1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3進行復配，當復配比例為3∶3∶1時，清除率最高為77.57%，且SE值為1.20，表明槲皮素、蘆丁對金銀花綠原酸具有較好的抗氧化協(xié)同增效作用。