樊迎，王雪婷，郭雅嫻，劉暢，董鵬飛

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院（晉中 030800）

丑橘又名丑柑，屬于雜柑的一種，學(xué)名“不知火”，是蕓香科柑橘屬植物的一種新型品種水果。因其口感極佳，已成為近年來(lái)深受消費(fèi)者喜愛(ài)的柑橘類水果。皮作為柑橘類水果的非食用部位，占鮮果質(zhì)量的20%～40%[1]。柑橘類水果皮中含有豐富的精油、微量元素、果膠、橙色素等[2]。其中，柑橘類水果皮精油具有令人愉悅的天然柑橘香氣，不僅氣味清新怡人，而且具有抑菌[3]、護(hù)肺[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[5]、保鮮[6]等作用，被稱為“液體黃金”，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品及食品工業(yè)中。

目前，從柑橘類水果的果皮中提取精油的方法主要有壓榨法[7]、溶劑浸提法[8]、水蒸氣蒸餾法[9]、超（亞）臨界流體萃取法[10-11]、超高壓法[12]等，也有不少學(xué)者會(huì)同時(shí)輔以超聲[13]、微波[14]、酶解[15]等手段，以提高精油提取的效率和品質(zhì)。研究表明，采用溶劑浸提法提取的桔皮精油，香味濃，檸檬烯含量高[16]，且此法操作簡(jiǎn)便、成本低，有較大的推廣價(jià)值。鮮見(jiàn)有丑橘皮精油提取的相關(guān)報(bào)道。試驗(yàn)采用超聲波輔助溶劑萃取法提取丑橘皮精油，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到提取丑橘皮精油的最佳工藝，并對(duì)其抑菌性進(jìn)行初探，以期為丑橘資源的綜合利用、精深加工及應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮丑橘，市售。試劑：石油醚、95%乙醇、正己烷，均為AR，天津市北辰方正試劑廠；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；菌種：細(xì)菌（枯草芽孢桿菌），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏；酵母菌（安琪高活性干酵母），購(gòu)于市場(chǎng)；霉菌（青霉），分離自發(fā)霉的橘皮表面。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備與儀器

CG-8200多功能研磨機(jī)，中山市長(zhǎng)柏電器實(shí)業(yè)有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB-3200DT超聲波儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；R206D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DH2500電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市通利信達(dá)儀器廠；等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

丑橘洗凈、去皮，將丑橘皮分批次放入烘箱中，于45 ℃烘干至恒質(zhì)量。用多功能研磨機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，得到丑橘皮粉，置于無(wú)菌密封袋中備用。

1.3.2 丑橘皮精油提取工藝

用電子天平稱取若干份10.00 g的丑橘皮粉，按照一定的料液比加入提取溶劑，超聲功率設(shè)置為100 W[17]，在一定溫度下浸提一段時(shí)間，過(guò)濾得到丑橘皮精油提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行減壓蒸餾分離溶劑后，得到丑橘皮精油，其得率按照式（1）計(jì)算：

1.3.3 提取條件的研究

以丑橘皮精油得率為考察指標(biāo)，先研究提取溶劑（正己烷、95%乙醇、石油醚）對(duì)提取效果的影響，確定出最優(yōu)提取溶劑，后續(xù)試驗(yàn)均以此溶劑作為提取劑；然后研究超聲浸提溫度、提取時(shí)間、料液比這3個(gè)因素對(duì)丑橘皮精油提取得率的影響。固定初始條件：浸提溫度45 ℃、提取時(shí)間50 min、料液比1∶6（g·mL-1）。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行操作，取平均值進(jìn)行分析。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理，以丑橘皮精油得率為響應(yīng)值，浸提溫度（A）、提取時(shí)間（B）和料液比（C）為3個(gè)試驗(yàn)因素，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。運(yùn)用Design-Expert V 8.0.6軟件系統(tǒng)進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立回歸模型，確定丑橘皮精油的超聲輔助提取法的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)各因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

1.3.5 丑橘皮精油抑菌性試驗(yàn)

1.3.5.1 菌懸液的制備

細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，酵母菌和霉菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。取受試菌種接種到提前制備好的液體培養(yǎng)基中活化24 h，重復(fù)2次后，取活化好的菌種，配成106～108個(gè)/mL的菌懸液，備用。

1.3.5.2 抑菌效力測(cè)定[18]

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定細(xì)菌的抑菌效力，先分別取0.1 mL枯草芽胞桿菌和酵母菌的菌懸液、青霉的孢懸液，倒入培養(yǎng)皿中涂抹均勻，直到感覺(jué)有黏稠感產(chǎn)生。取直徑大小為6 mm無(wú)菌濾紙小圓片，在丑橘皮精油中充分浸泡12 h后放置于平板中，以6 mm未浸泡過(guò)丑橘皮精油的濾紙片放入含菌培養(yǎng)皿中作為對(duì)照，所有操作均進(jìn)行3次重復(fù)。酵母菌和青霉在28 ℃下培養(yǎng)48 h，枯草芽胞桿菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，測(cè)抑菌圈直徑并取平均值。敏感度判定標(biāo)準(zhǔn)[19]：抑菌圈直徑大于20 mm，極敏感；15～20 mm，高敏感；10～15 mm，中敏感；8～10 mm，低敏感；小于7 mm，不敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 丑橘皮精油提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑的確定

分別用3種有機(jī)溶劑來(lái)提取丑橘皮精油，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1表明，用所選的3種溶劑提取丑橘皮精油，得率由高及低依次為：正己烷＞石油醚＞95%乙醇。95%乙醇的提取效果及精油品質(zhì)均不佳。石油醚和正己烷是較好的提取劑，二者的精油得率均較高，且差異不大。石油醚提取所得精油為橙黃色、澄清透明，正己烷提取得到的精油為黃色，稍顯黏稠，澄清度不及前者。加之石油醚具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)，故選用石油醚作為后續(xù)試驗(yàn)的提取溶劑。

2.1.2 超聲浸提溫度對(duì)丑橘皮精油得率的影響

運(yùn)用上組定好的提取溶劑，在其他條件一致的情況下，改變丑橘皮粉的浸提溫度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可知，隨著溫度升高，丑橘皮精油得率逐漸升高，當(dāng)浸提溫度為55 ℃時(shí)，丑橘精油得率最高，再升高溫度，得率不再呈原有的緩慢平緩升高趨勢(shì)，超過(guò)55 ℃后，反而呈現(xiàn)出微下降趨勢(shì)。因?yàn)榫鸵讚]發(fā)，提高浸提溫度并不能一直提高丑橘皮精油得率，超過(guò)一定溫度后，丑橘皮精油揮發(fā)散失量增大，得率由此而降低。圖2折線總趨勢(shì)趨于平緩，說(shuō)明溫度對(duì)丑橘皮精油得率影響稍弱。最佳浸提溫度為55 ℃。

圖1 不同提取溶劑對(duì)丑橘皮精油提取效果的影響

圖2 超聲浸提溫度對(duì)丑橘皮精油得率的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)丑橘皮精油得率的影響

在前2組確定的提取溶劑和浸提溫度條件下，只改變超聲輔助提取的時(shí)長(zhǎng)，所得丑橘皮精油得率如圖3所示。

從圖3可知，隨著超聲輔助提取時(shí)間的延長(zhǎng)，丑橘皮精油得率有較大幅度的升高，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為60 min時(shí)，丑橘精油得率最高，隨后繼續(xù)增加提取時(shí)間，丑橘皮精油得率反而略有下降，這可能是因?yàn)槌曁幚頃r(shí)間過(guò)短，丑橘皮細(xì)胞壁破裂及胞內(nèi)熱效應(yīng)程度低，精油無(wú)法完全溶出，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，丑橘皮細(xì)胞壁破裂程度提高，精油充分溶出，但如果超聲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則其升溫效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致部分丑橘皮精油揮發(fā)，導(dǎo)致得率下降[20]。因此超聲最佳處理時(shí)間為60 min。

2.1.4 料液比對(duì)丑橘皮精油得率的影響

在前3組確定的溶劑、浸提溫度和超聲時(shí)間條件下，研究不同料液比對(duì)丑橘皮精油提取得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4顯示，丑橘皮粉與石油醚的比例在1∶2～1∶6（g·mL-1）的范圍內(nèi)，丑橘皮精油得率隨著料液比的增加而升高，這主要是因?yàn)閷?duì)于一定量的丑橘皮粉，增加料液比，丑橘皮粉與石油醚接觸面的濃度差就越大，越有利于丑橘精油從細(xì)胞組織中脫離出來(lái)；當(dāng)料液比大于1∶6（g·mL-1）時(shí)，精油得率并沒(méi)持續(xù)上升，反而出現(xiàn)下降的情形，這是由于繼續(xù)增加溶劑用量，部分超聲波輻射能會(huì)被溶劑吸收[21]，同時(shí)，其他脂溶性成分競(jìng)爭(zhēng)溶解量增加，導(dǎo)致丑橘皮精油的得率降低。綜上所述，料液比取1∶6（g·mL-1）最合適。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)丑橘皮精油得率的影響

圖4 料液比對(duì)丑橘皮精油得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在Box-Behnken試驗(yàn)原理的基礎(chǔ)上，以超聲輔助丑橘皮精油提取的浸提溫度（A）、提取時(shí)間（B）和料液比（C）為自變量，丑橘皮精油得率（Y）為響應(yīng)值，用Design-Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平的二次多項(xiàng)式回歸擬合分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析

應(yīng)用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)表2中的丑橘皮精油得率結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，所建立的二次回歸模型為：Y=2.548+0.118 75A+0.255B+0.226 25C-0.027 5AB+0.015AC+0.062 5BC-0.164A2-0.381 5B2-0.204C2。對(duì)此模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，回歸模型的F值為87.84、p值＜0.01，表明模型顯著，失擬項(xiàng)p值=0.095 6＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)差異不顯著，可知此模型可很好地描述丑橘皮精油得率和各提取因素之間的關(guān)系；同時(shí)，此模型的決定系數(shù)R2=0.991 2，調(diào)整系數(shù)AdjR2=0.979 9，表明此模型擬合程度好，可以解釋響應(yīng)面中99.12%的可變性，總變異中只有2.01%不能用此模型解釋。故可認(rèn)為所選用的二次回歸模型是合適的，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響很小，可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)丑橘皮精油的提取得率。F值越大，說(shuō)明此因素對(duì)丑橘皮精油提取得率的影響越大，故可判斷出所考察的這3種因素影響大小順序?yàn)椋禾崛r(shí)間（B）＞料液比（C）＞浸提溫度（A）。模型中一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2均對(duì)丑橘皮精油提取得率的影響達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)BC對(duì)其影響達(dá)到顯著水平，說(shuō)明超聲輔助提取時(shí)間和料液比2個(gè)因素對(duì)丑橘皮精油提取得率的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，有必要做交互作用分析。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 丑橘皮精油得率的方差分析表

通過(guò)對(duì)模型方程求導(dǎo)，得到方程的最優(yōu)解即丑橘皮精油的預(yù)測(cè)得率的最大值（2.685%），此值對(duì)應(yīng)的各因素最佳條件分別為：浸提溫度（A）56.3 ℃、提取時(shí)間（B）61.3 min、料液比（C）1∶6.13（g·mL-1）。

2.2.2 最佳提取工藝驗(yàn)證

為了驗(yàn)證丑橘皮精油提取的最佳工藝條件，同時(shí)考慮實(shí)際操作的可行性，將最佳提取條件設(shè)置為提取溫度56 ℃、超聲輔助提取時(shí)間61 min、固液比1∶6.1（g·mL-1），在此條件下重復(fù)驗(yàn)證3次所得到的丑橘皮精油的得率為2.68%±0.09%，與預(yù)測(cè)值十分接近，說(shuō)明此二次多項(xiàng)式回歸方程對(duì)丑橘皮精油得率的預(yù)測(cè)是可靠的，此試驗(yàn)條件可用于超聲輔助丑橘皮精油的提取優(yōu)化。

2.2.3 響應(yīng)面及交互作用分析

響應(yīng)曲面圖和等高線圖是經(jīng)過(guò)軟件繪制的，分別為三維立體曲面圖和二維平面生成的等高線圖，可直觀反映出各個(gè)因素的單獨(dú)作用效果和因素交互作用結(jié)果，如圖5～圖7所示。

圖5 浸提溫度和提取時(shí)間對(duì)丑橘精皮油得率的交互作用

圖6 浸提溫度和料液比對(duì)丑橘精皮油得率的交互作用

圖7 浸提時(shí)間和料液比對(duì)丑橘精皮油得率的交互作用

觀察圖5～圖7的響應(yīng)面圖，發(fā)現(xiàn)均為開(kāi)口向下的曲面圖，顯示為負(fù)值，形如山丘一樣中間拱起，而四周相對(duì)較低的曲面，代表著存在有極大值[19]。比較3個(gè)曲面圖，可以看出提取時(shí)間的曲線最陡峭，表明其對(duì)丑橘皮精油提取得率的影響最大，這與2.2.1中方差分析結(jié)果相一致；通過(guò)比較3個(gè)等高線圖，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間和料液比的交互作用最顯著，表現(xiàn)為等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形且最密集。而其他2個(gè)等高線圖則更接近于圓形，且排列不太密集，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面圖線也較為平緩，說(shuō)明浸提溫度和料液比、浸提溫度和提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)丑橘皮精油得率的影響不顯著。

2.3 丑橘皮精油的抑菌性能

試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌、酵母菌和青霉3種供試菌種作為研究丑橘皮精油抑菌性的對(duì)象，考察丑橘精油的抑菌能力。由表4可知，丑橘皮精油對(duì)于各類微生物均有著抑制作用，并產(chǎn)生明顯的抑菌圈，而在對(duì)照試驗(yàn)中，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的抑菌圈，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可以作為丑橘皮精油抑菌性能試驗(yàn)的理論依據(jù)。其中：霉菌的抑菌圈最小，說(shuō)明丑橘皮精油對(duì)于霉菌的抑菌效果最弱；枯草芽胞桿菌的抑菌圈最大，說(shuō)明抑制枯草芽胞桿菌對(duì)丑橘皮精油高度敏感，而對(duì)酵母菌抑制能力一般。

表4 丑橘精油抑菌性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)首先通過(guò)3種提取劑對(duì)比，確定石油醚為丑橘皮精油的最佳提取溶劑；根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用相響應(yīng)曲面法優(yōu)化分析，并結(jié)合實(shí)際操作得到丑橘皮精油提取的最優(yōu)工藝：浸提溫度56 ℃、超聲輔助提取時(shí)間61 min、料液比1∶6.1（g·mL-1）。此最優(yōu)條件下丑橘皮精油得率最高可達(dá)到2.68%±0.09%。該方法成本低廉、操作簡(jiǎn)便、提取時(shí)間短，可為丑橘資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

提取所得丑橘皮精油對(duì)各類微生物均有不同程度的抑菌能力，其對(duì)枯草芽胞桿菌抑制能力最強(qiáng)，其次為酵母菌，而對(duì)霉菌的抑菌性一般。今后，可對(duì)丑橘皮精油進(jìn)行純化后進(jìn)一步分析其抑菌成分，探究其抑菌機(jī)理。這不僅可以提高丑橘的利用價(jià)值，還將為食品貯藏保鮮、化妝品開(kāi)發(fā)、天然清新劑研制等領(lǐng)域提供新的應(yīng)用思路，發(fā)展前景廣闊。