白青云，趙立，劉明亞

淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院（淮安 223003）

南瓜作為一種常見的食材，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多糖及蛋白質(zhì)等，具有預(yù)防糖尿病、動(dòng)脈硬化、溶解結(jié)石、催化分解致癌物質(zhì)等作用，且價(jià)格低廉，已然成為食品界的新寵[1]。

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是生物體內(nèi)廣泛存在的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，由谷氨酸（Glu）經(jīng)谷氨酸脫羧酶（GAD EC 4.1.1.15）脫羧產(chǎn)生，是哺乳動(dòng)物大腦中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、利尿、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、改善失眠以及腎肝功能活化等作用[2]。植物組織中GABA含量很低，不能滿足人體需要，因此，提高GABA含量的方法成為研究熱點(diǎn)。報(bào)道稱，植物受到低氧、冷激、熱激、干旱、鹽脅迫和機(jī)械傷害等逆境脅迫時(shí)體內(nèi)GABA含量明顯升高[3]。目前，關(guān)于食物富集GABA的方法屢見報(bào)道，如茶葉采用厭氧處理富集GABA[4]、麥胚采用水浴保溫富集GABA[5]、馬鈴薯采用浸漬法富集GABA[6]等。

目前，南瓜主要作為蔬菜烹飪食用，加工品主要有南瓜粉、南瓜醬、南瓜果脯蜜餞、南瓜飲料等低層次的加工應(yīng)用，而對(duì)于南瓜中的活性物質(zhì)沒有充分的開發(fā)和利用。張華等[7]測(cè)定南瓜中Glu含量豐富，并含有一定量的GABA。鮮切南瓜因新鮮方便和健康衛(wèi)生等特點(diǎn)受到消費(fèi)者青睞，需求量日益增長(zhǎng)。試驗(yàn)選用種植面廣、糧蔬兼用的南瓜為原料，采用浸漬方法研究鮮切南瓜富集GABA的關(guān)鍵技術(shù)，優(yōu)化技術(shù)參數(shù)，為開發(fā)富含GABA的南瓜食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、設(shè)備與儀器

生鮮南瓜，市售新鮮原料，品種為錦紅一號(hào)，購(gòu)買后貯藏于0～4 ℃密封環(huán)境中，備用；GABA標(biāo)品，購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)品公司；谷氨酸鈉（MSG）、維生素B6（VB6）、CaCl2，購(gòu)于食品添加劑公司，均為食品級(jí)；其他試劑，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

TDL-40B型離心機(jī)，上海安亭儀器廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；V-1000型可見分光光度計(jì)，上海翔藝儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；101-1BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FK-A組織搗碎勻漿機(jī)，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

將挑選好的南瓜洗凈后用1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min，然后去皮去瓤，切成塊狀，放入燒杯，加入浸漬液，要使得燒杯內(nèi)溶液完全浸沒鮮切南瓜，用保鮮膜封好燒杯口置于恒溫培養(yǎng)箱中于一定溫度下放置一定時(shí)間，浸漬結(jié)束后取出樣品，測(cè)定其GABA含量。

1.2.2 浸漬工藝對(duì)鮮切南瓜富集GABA的影響

對(duì)影響南瓜富集GABA的浸漬工藝，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，設(shè)定浸漬溫度為20～50 ℃，浸漬時(shí)間為2～8 h，浸漬液pH為4.6～6.4（檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液），在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理的三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化鮮切南瓜富集GABA的最適浸漬工藝。

1.2.3 浸漬液組分對(duì)鮮切南瓜富集GABA的影響

為進(jìn)一步提高鮮切南瓜中GABA含量，在最適工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)影響GABA富集的浸漬液添加物MSG、VB6和CaCl2的最適濃度進(jìn)行研究。分別配制不同濃度的各組分溶液，所有溶液均由10 mmol/L的檸檬酸緩沖液配制而成，調(diào)節(jié)初始pH至5.8，MSG質(zhì)量濃度設(shè)為6～18 mg/mL；VB6濃度設(shè)為0.1～0.4 mmol/mL；CaCl2濃度設(shè)為1.0～4.0 mmol/L。對(duì)影響鮮切南瓜GABA富集的浸漬液組分采用Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，以GABA含量作為考察值。

1.3 GABA測(cè)定方法

將富集GABA后的鮮切南瓜樣品用組織搗碎機(jī)磨碎后，精確稱取1 g左右樣品于20 mL離心管中，加入6 mL 7%的乙酸提取1 h后以4 000 r/min離心10 min，上清液中再加入4 mL無(wú)水乙醇沉淀30 min，以4 000 r/min離心10 min后，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用1 mL蒸餾水溶解后以10 000 r/min離心10 min，上清液用于測(cè)定GABA含量。GABA含量測(cè)定參照白青云等[8]的方法，采用比色法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以x±SD表示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件采用設(shè)計(jì)專家Design Expert 7.0軟件，采用SPSS 16.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸漬工藝對(duì)鮮切南瓜中GABA含量的影響

2.1.1 溫度對(duì)鮮切南瓜富集GABA的影響

由圖1可見，在20～50 ℃范圍內(nèi)，鮮切南瓜處理6 h的條件下（培養(yǎng)液pH 5.8），溫度對(duì)鮮切南瓜GABA含量有顯著影響，呈先上升后下降的趨勢(shì)，40 ℃時(shí)GABA含量最高（0.213 mg/g），分別為20和50 ℃的2.55倍和1.08倍。溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，從而導(dǎo)致Glu無(wú)法轉(zhuǎn)化成GABA或者轉(zhuǎn)化率低。馬鈴薯浸漬富集GABA的最適溫度為35 ℃[6]，鮮切胡蘿卜中GABA含量也會(huì)隨著貯藏溫度的升高而增加[9]。研究中，鮮切南瓜提高GABA含量的適宜浸漬溫度定為40 ℃。

圖1 溫度對(duì)鮮切南瓜中GABA含量的影響

2.1.2 浸漬時(shí)間對(duì)鮮切南瓜GABA含量的影響

在溫度30 ℃、培養(yǎng)液pH 5.8的條件下，鮮切南瓜中GABA含量隨浸漬時(shí)間的延長(zhǎng)而變化的情況見圖2。從圖2可以看出，隨著浸漬時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮切南瓜中GABA含量呈先緩慢增加而后急劇增加又降低的趨勢(shì)，浸漬6 h含量最高，是浸漬2 h的3.41倍；浸漬4 h與8 h鮮切南瓜中GABA含量無(wú)顯著差異（p＜0.05）。因此，選擇浸漬6 h為鮮切南瓜富集GABA的適宜時(shí)間。

圖2 時(shí)間對(duì)鮮切南瓜中GABA含量的影響

2.1.3 浸漬液pH對(duì)鮮切南瓜中GABA含量的影響

在浸漬溫度30 ℃、浸漬時(shí)間6 h的條件下，浸漬液pH對(duì)鮮切南瓜中GABA富集的影響結(jié)果見圖3。pH在4.6～6.4之間，GABA含量隨pH的升高先升高后下降。當(dāng)pH為5.8時(shí)，GABA含量最高（0.207 mg/g），分別比pH4.6和6.4時(shí)含量提高63.81%和22.66%。酸性環(huán)境下有利于植物GABA的富集[10]，不同原料GAD最適pH不同。研究表明，南瓜GAD的最適pH為5.8，在該pH下酶活力最高，同時(shí)酶活力隨pH的升高呈先增后降的趨勢(shì)[11]。試驗(yàn)得出的結(jié)論與此研究結(jié)果一致。因此，鮮切南瓜富集GABA的適宜pH定為5.8。

2.1.4 正交試驗(yàn)法優(yōu)化鮮切南瓜富集GABA的培養(yǎng)條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以浸漬時(shí)間（A）、浸漬溫度（B）和浸漬液pH（C）三因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化鮮切南瓜富集GABA的最適培養(yǎng)工藝，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1的正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，鮮切南瓜富集GABA的最適浸漬條件為A1B2C2，即浸漬時(shí)間4 h、浸漬溫度40℃、浸漬液pH 5.8。極差分析可知，浸漬溫度是最主要的影響因素，浸漬時(shí)間次之，最后是浸漬液pH。在最適浸漬工藝下，鮮切南瓜中GABA含量為0.291 mg/g，是原料的5.43倍（南瓜原料中GABA含量測(cè)定為0.053 6 mg/g）。

2.2 浸漬液組分對(duì)鮮切南瓜富集GABA的影響

2.2.1 MSG對(duì)鮮切南瓜GABA含量的影響

由圖4可知，隨著浸漬液中MSG濃度的增加，鮮切南瓜中GABA含量呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。當(dāng)MSG質(zhì)量濃度為14 mg/mL時(shí)，GABA含量最高（0.484 mg/g），是添加6 mg/mL MSG的1.81倍。植物GAD的直接底物是Glu，MSG是其鈉鹽，可以提供Glu，作為植物GAD的底物，促進(jìn)GABA的合成[10]。馬鈴薯浸漬中添加MSG可以促進(jìn)GABA的富集[6]，研究結(jié)果與其一致。底物也不能過(guò)多，否則會(huì)起反饋抑制作用。Bai等[12]研究得出，過(guò)多的Glu會(huì)降低GAD活性，從而抑制GABA積累。

圖4 MSG質(zhì)量濃度對(duì)鮮切南瓜GABA含量的影響

2.2.2 CaCl2對(duì)鮮切南瓜GABA含量的影響

CaCl2對(duì)鮮切南瓜中GABA富集的影響見圖5。隨著CaCl2濃度的增加，鮮切南瓜中GABA含量呈先增長(zhǎng)后下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)CaCl2濃度為3.0 mmol/L時(shí)，GABA富集量最大，比添加1 mmol/L CaCl2提高34.28%。植物GAD受Ca2+的調(diào)節(jié)，增加Ca2+會(huì)刺激GAD活性，促進(jìn)GABA的積累[13]。低氧脅迫下發(fā)芽粟谷中GABA含量由于Ca2+濃度的增加顯著提高[12]。

圖5 CaCl2濃度對(duì)鮮切南瓜GABA含量的影響

2.2.3 VB6對(duì)鮮切南瓜中GABA含量的影響

浸漬液中添加VB6提高了鮮切南瓜中GABA的含量（圖6）。GABA含量隨VB6添加量的增加而提高，當(dāng)VB6為0.3 mmol/mL時(shí)，GABA含量最高，但添加0.4 mmol/mL VB6無(wú)顯著差異。研究表明，VB6是GAD的輔基磷酸吡哆醛（PLP）的前體物質(zhì)，在磷酸緩沖液中可轉(zhuǎn)化為PLP，激活GAD達(dá)到富集GABA的作用[14]。適量添加VB6促進(jìn)GABA積累。試驗(yàn)中，鮮切南瓜富集GABA的適宜VB6添加量為0.3 mmol/mL。

圖6 VB6濃度對(duì)鮮切南瓜GABA含量的影響

2.2.4 鮮切南瓜富集GABA的浸漬液組分優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)鮮切南瓜富集GABA的浸漬液組分CaCl2濃度（X1）、MSG濃度（X2）和VB6濃度（X3）進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方案和相應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

利用Design Expert 7.0軟件，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元逐步回歸擬合，得到鮮切南瓜富集GABA預(yù)測(cè)值的二次多項(xiàng)逐步回歸方程：

表2 鮮切南瓜富集GABA的浸漬液組分Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析（表3），結(jié)果表明，回歸模型的F=35.00，p＜0.000 1，模型顯著，其決定系數(shù)R2=0.978 3，說(shuō)明此模型相關(guān)性良好，模型具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。

表3 回歸模型方差分析

根據(jù)回歸法分析所得二次方程，在試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，得到對(duì)響應(yīng)值有顯著交互作用影響的兩因素的響應(yīng)曲面圖，見圖7。

當(dāng)VB6濃度為0.3 mmol/mL時(shí)，MSG和CaCl2對(duì)鮮切南瓜中GABA富集的交互作用影響見圖7。MSG和CaCl2的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)分別對(duì)鮮切南瓜GABA含量有極顯著的影響（p＜0.01），兩者的交互作用也影響顯著（p=0.000 9）（表3）。在固定的MSG濃度下，GABA含量隨CaCl2濃度的增加呈先快速增加隨后下降的趨勢(shì)。當(dāng)CaCl2濃度為3.35 mmol/L時(shí)，GABA富集量最大。當(dāng)MSG質(zhì)量濃度為10.24 mg/mL，GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物，添加適量的MSG可以促進(jìn)GABA合成，形成有效積累[10]。Ca2+是GAD的激活劑，通過(guò)與GAD碳末端的Ca2+/CaM調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合而激活其活性[13]，促進(jìn)GABA富集。低氧通氣下，MSG與CaCl2的聯(lián)合處理可顯著促進(jìn)GABA含量的提高[8]，研究結(jié)果與此報(bào)道結(jié)果一致。

圖7 MSG和CaCl2的交互作用對(duì)鮮切南瓜GABA含量影響的響應(yīng)曲面圖

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果，鮮切南瓜富集GABA的最佳培養(yǎng)液組分濃度分別為CaCl2濃度3.35 mmol/L、MSG質(zhì)量濃度10.24 mg/mL和VB6濃度0.37 mmol/mL，在此條件下鮮切南瓜富集GABA的預(yù)測(cè)值為0.546 mg/g，驗(yàn)證試驗(yàn)得出實(shí)測(cè)值為0.569 mg/g，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間存在較高的擬合度，所建立的模型是可靠的，可以用來(lái)描述組分濃度與響應(yīng)值之間的關(guān)系。以最適浸漬液濃度培養(yǎng)的鮮切南瓜GABA含量是是原料中的10.62倍，說(shuō)明優(yōu)化后的浸漬液組分能顯著提高鮮切南瓜中GABA含量。

3 結(jié)論

首先研究了鮮切南瓜富集GABA的工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果表明，浸漬液pH、浸漬溫度和浸漬時(shí)間對(duì)鮮切南瓜GABA富集有顯著影響，三因素的影響順序依次為浸漬溫度＞浸漬時(shí)間＞浸漬液pH，最佳的浸漬工藝為浸漬時(shí)間4 h，浸漬溫度40 ℃，浸漬液pH 5.8，此時(shí)鮮切南瓜中GABA的富集量為0.291 mg/g，是原料的5.43倍。接著研究了浸漬液組分對(duì)鮮切南瓜富集GABA的影響，響應(yīng)面的Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果表明，鮮切南瓜富集GABA的最佳浸漬液組分濃度為CaCl23.35 mmol/L、MSG 10.24 mg/mL和VB6濃度0.37 mmol/mL，在此條件下鮮切南瓜中GABA含量為0.569 mg/g，是原料的10.62倍。方差分析可知，CaCl2、MSG、VB6對(duì)鮮切南瓜中GABA的富集均有顯著影響，MSG和CaCl2的交互作用對(duì)鮮切南瓜中GABA富集有顯著影響。