張鈺林 王 楓

1(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

2(中國科學院大學 北京 100049)

1 引 言

內源性大麻素系統(tǒng)(Endocannabinoid System，ECS)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在疼痛、運動功能、麻醉與覺醒、學習記憶和情緒情感以及神經(jīng)發(fā)生等生理過程和行為中發(fā)揮著重要的調控作用[1-7]。ECS 由內源性大麻素(Endocannabinoids)、大麻素 I 型受體(Cannabinoid Receptor 1，CB1R)、大麻素 II 型受體(Cannabinoid Receptor 2)、合成酶、代謝酶及轉運體組成[7-8]。其中，內源性大麻素主要包括花生四烯酸乙醇胺(Anandamide)和 2-花生?；视?2-Arachidonoylglycerol)，作為一種逆行作用的神經(jīng)遞質，與突觸前膜上的 CB1R 結合后，對該突觸發(fā)揮調控作用。CB1R 廣泛位于與焦慮、恐懼和應激等相關的大腦區(qū)域中，調控神經(jīng)遞質釋放，并作為大麻素治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要潛在靶點[9]。外周神經(jīng)系統(tǒng)中也少量表達 CB1R，它們分散地表達在神經(jīng)肌肉接頭處[10]。

大量的研究表明，斑馬魚、嚙齒類動物、狗、非人靈長類動物以及人類的腦內都分布著大量的 CB1R[11-12]。作為神經(jīng)系統(tǒng)中最為豐富的 G 蛋白耦聯(lián)受體[13-14]，CB1R 參與調節(jié)多種腦生理過程。通過放射自顯影術、免疫組織化學和原位雜交等方法，CB1R 在大腦中的解剖學分布已被廣泛研究。腦內的 CB1R 主要表達在大腦皮層、基底神經(jīng)節(jié)、海馬體、杏仁核、丘腦和下丘腦，以及大腦腳、腦橋核、中腦導水管周圍灰質和小腦皮層等結構中[12,15-18]。但 CB1R 的表達具有腦區(qū)特異性，如在前腦分布相對密集，而在后腦分布則相對稀疏[18]。其中，在海馬體、紋狀體和黑質中的神經(jīng)元以及小腦皮質中的蒲肯野細胞(Purkinje Cell)上的表達豐度最高，嗅球、扣帶皮層、內嗅皮層和梨狀皮層，以及杏仁核和伏隔核次之，而在丘腦和下丘腦神經(jīng)元上的表達則很低。CB1R 的這種差異性分布模式可能與大麻素對學習與記憶、情緒與認知，以及運動控制等的調節(jié)作用有關[19]，也可能為預測和治療與 ECS 相關的神經(jīng)和心理疾病提供幫助。比如，大麻素激活海馬體膠質細胞上的 CB1R，使 CA3-CA1 興奮性突觸發(fā)生長時程抑制，進而導致工作記憶損傷[20]。海馬體 γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid，GABA)能神經(jīng)元上的 CB1R 則直接參與了低顯著性線索相關的聯(lián)想型學習[21]。中腦導水管周圍灰質、延髓以及脊髓后角上的 CB1R 介導了疼痛信號的傳遞[22]，且 CB1R 與神經(jīng)病理性疼痛導致的抑郁癥狀也存在相關性[23]。此外，本文作者課題組研究發(fā)現(xiàn) CB1R 陽性細胞在小鼠的眶額皮層、島葉皮層、次級視覺皮層、紋狀體、穹窿和背側下丘腦等腦結構中的分布呈現(xiàn)雌雄差異特征[24]。綜上，探究 ECS 結構和功能及其性別差異有助于開發(fā)和完善大麻素對神經(jīng)精神疾病的精準治療方式。

ECS 發(fā)揮調控作用時往往與其他神經(jīng)遞質在結構和功能上相互作用。在成年斑馬魚[25-26]和小鼠[27]大腦中，食欲素 I 型和 II 型受體與 CB1R 廣泛共表達在同一神經(jīng)元上，參與復雜的大腦功能，如疼痛、攝食和睡眠-覺醒等[28-29]。靈長類動物的背外側前額葉皮質中 91% 的 CB1R 陽性(CB1R＋)神經(jīng)元表達膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)，51% 的 CCK 陽性(CCK+)神經(jīng)元表達 CB1R，CB1R＋/CCK＋神經(jīng)元活動的改變則與精神分裂癥患者的皮層網(wǎng)絡振蕩和工作記憶紊亂有關[30-32]。生長激素抑制素受體和 CB1R 共表達在大腦皮層、紋狀體和海馬體神經(jīng)元上，二者相互作用可降低大麻素產生的副作用，為改善藥物濫用提供了新的可能性[33-34]。CB1R 在 GABA 能和谷氨酸能神經(jīng)元上的平衡被破壞與亨廷頓式舞蹈癥有關[35]。其他研究表明皮層和海馬體中的 CB1R 神經(jīng)元與多巴胺神經(jīng)元和 5-羥色胺神經(jīng)元都存在共標[36-38]。上述研究證實，CB1R 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中許多常見的神經(jīng)遞質，如 CCK、GABA、多巴胺、谷氨酸、5-羥色胺、生長激素抑制素、食欲素等的受體存在共表達，提示 ECS 參與調節(jié)這些神經(jīng)遞質的釋放。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還存在一類重要的抑制性神經(jīng)元——小清蛋白(Parvalbumin，PV)神經(jīng)元。PV 神經(jīng)元是腦內最多且最重要的中間神經(jīng)元，約占中間神經(jīng)元總數(shù)的 40%，大量分布在皮層和皮層下結構中，呈現(xiàn)籃狀或吊燈樣形態(tài)，放電頻率高且強烈，廣泛投射到大腦其他區(qū)域[39]，可特異性地發(fā)揮阻滯功能。如選擇性地阻斷海馬體 PV 陽性(PV＋)神經(jīng)元的突觸傳遞，則會干擾小鼠對熟悉動物和陌生動物的辨別，擾亂了社交記憶的提取[40]。而激活小鼠上丘中的 PV＋神經(jīng)元可誘發(fā)本能防御反應，形成恐懼記憶，重復激活這些神經(jīng)元則可引起抑郁樣行為[41]。PV 神經(jīng)元還在神經(jīng)發(fā)生、多感覺注意、情緒認知、新物體識別等方面發(fā)揮重要調控作用[39,42]。然而，當前卻鮮有 PV 神經(jīng)元是否與 CB1R 神經(jīng)元共標的相關報道[43-44]。

為此，本研究圍繞中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 CB1R 是否與 PV 共表達這一問題展開。通過構建帶有綠色熒光報告蛋白的 CB1R-iCre-EGFP 轉基因小鼠，借助免疫熒光染色和激光共聚焦顯微成像技術，在小鼠的背側和腹側 CA1、CA2、CA3 以及齒狀回(Dentate Gyrus，DG)中發(fā)現(xiàn)少量神經(jīng)元同時表達 PV 和 CB1R，且這些 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在上述腦區(qū)中的分布密度和比例未見雌雄差異。本研究從定性和定量的角度證明小鼠海馬體神經(jīng)元存在 CB1R 和 PV 共表達，該結果為進一步闡明 CB1R 和 PV 在結構和功能上的相互作用提供一定參考價值，也將有助于更全面地了解 ECS 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的調控作用。

2 材料與方法

2.1 動物

實驗動物采用 CB1R-iCre-EGFP 轉基因動物，來源于中國科學院深圳先進技術研究院，由純合的 CB1R-iCre-EGFP 小鼠與野生型 C57BL/6J 小鼠雜交得到。實驗所用雌雄小鼠各 6 只，年齡為 8～12 周，其中雌鼠體重 20～22 g、雄鼠體重 25～28 g。小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體的屏障環(huán)境內，光照/黑暗周期為 12 h/12 h，相對濕度為 40%～70%，光照強度為 15～20 lx。飼養(yǎng)期間，提供給小鼠充足的食物和水，每周更換新墊料，保證其生活環(huán)境健康舒適。實驗動物方案經(jīng)由中國科學院深圳先進技術研究院動物倫理委員會審查(SIAT-IRB-170314-NS-WLP-A0345)通過。

2.2 樣品采集

2.2.1 溶液的準備

準備及配制實驗所需的各種溶液，包括磷酸緩沖液(Phosphate Buffer Solution，PBS)、4% 多聚甲醛溶液、30% 蔗糖溶液、1% 戊巴比妥鈉溶液等。具體地，PBS 溶液配制:將 PBS 緩沖液粉劑(武漢博士德生物工程有限公司)溶解于去離子水中，調節(jié) pH 為 7.2～7.4。4% 多聚甲醛溶液(武漢博士德生物工程有限公司)保存于－20 ℃ 冰箱中，實驗前解凍備用。30% 蔗糖溶液配制:將分析純的蔗糖粉末(上海凌峰化學試劑有限公司)，按照 30% 的質量與體積比，溶解于 PBS 緩沖液中，保存于 4 ℃ 冰箱中。1% 戊巴比妥鈉溶液配制:將戊巴比妥鈉粉末，按照 1% 的質量與體積比，溶解于 0.9% 氯化鈉注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司)中，于室溫條件下保存。

2.2.2 灌注及組織固定

用 1% 戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，麻醉劑量標準為 0.1 mL/10 g 體重。待小鼠深度麻醉后，將其腹部朝上固定在實驗臺上，用手術剪剪開腹腔和胸腔，并用止血鉗外翻胸部組織，使心臟充分暴露，然后小心地去除心臟表面的筋膜。接著將注射針小心地插入左心室心尖，用剪刀快速地剪開右心耳，打開蠕動泵，使 PBS 溶液進入小鼠的體液循環(huán)(15 mL/min)，以排除全身的血液。其中，血液排盡的標準為小鼠肝臟由暗紅色變?yōu)槿榘咨?。而后，迅速將蠕動泵的溶液更換為 4% 多聚甲醛，每只小鼠灌注 10～12 mL 4% 多聚甲醛溶液，可初步固定腦組織。再用鑷子剝出腦袋，放于裝有 4% 多聚甲醛溶液的玻璃瓶中 1～2 天，以便充分固定。最后將 4% 多聚甲醛溶液更換為 30% 蔗糖溶液，使其脫水固定。其中，脫水的標準為，腦組織完全沉淀到瓶底，一般需要 2～3 天時間。

2.3 組織切片

腦組織完全固定后，放于塑料腦模具中，加入冰凍包埋劑(Opti-mum Cutting Temperature，OCT；Sigma)復合物，置于冰凍切片機(Leica CM1950)的冷凍室。待其凝固后，將組織固定在托盤上，前后左右調整位置，使腦組織切片的橫截面與小鼠腦圖譜上的結構基本一致。隨后進行組織切片(厚度為 30 μm)。收集目標腦區(qū)的腦片，放于加有 PBS 溶液的 24 孔板中，于 4 ℃ 冰箱中保存。

2.4 免疫熒光染色與貼片

從雌雄小鼠腦組織切片中挑選出含有背側和腹側海馬體的腦片，放于新的 24 孔板中，加入 PBS 溶液，置于室溫搖床上(90 r/min)清洗腦片，共 3 次，每次 5 min。接著用吸管移除 24 孔板中的 PBS 溶液，加入第一抗體(一抗)進行孵育。其中，用于雙染的一抗為兔源 Anti-GFP antibody (ab6556, Abcam)和鼠源 Anti-Parvalbumin antibody (MAB1572, Sigma-Aldrich)，使用前采用免疫熒光抗體稀釋液進行稀釋，兩者稀釋比例均為 1∶500。免疫熒光抗體稀釋液的配制方法如下:稱量 0.03 g 疊氮化鈉、0.25 g 角叉菜膠、5 g 胎牛血清白蛋白、量取0.3 mL 100%TritonX-100，放于滴瓶中，隨后加入 PBS 緩沖液定容至 100 mL，保存于 4 ℃ 冰箱中。加入一抗孵育液后，將 24 孔板置于室溫搖床上孵育 1 h，再更換到 4 ℃ 搖床上(90 r/min)孵育 24 h。然后移除一抗孵育液，用 PBS 溶液清洗腦片(方法同上)。加入用抗體稀釋液稀釋好的第二抗體(二抗)進行孵育。其中，用于雙染的熒光二抗為 Goat anti-Rabbit 488(131416, Jackson Research)和 Goat anti-Mouse 594(ab150116, Abcam)，兩者稀釋比例均為 1∶300。將加入熒光二抗的 24 孔板用錫箔紙包裹住，置于室溫搖床上避光孵育 1.5～2 h。隨后去除熒光二抗，滴加稀釋比例為 1∶10 000 的 4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI)熒光染料，放于室溫搖床上避光孵育 5 min。待孵育完成后，再次用 PBS 溶液清洗腦片(方法同上)。

用毛筆將腦片貼在載玻片上面，室溫下避光風干后，滴加抗熒光衰減封片劑FluoromountTM(Sigma)，并用蓋玻片封片；待玻片完全干透后，放于玻片收納盒，保存于 4 ℃冰箱中以備后續(xù)成像使用。

2.5 顯微成像與細胞計數(shù)

利用高靈敏度共聚焦顯微鏡(LSM 880，Zeiss)對組織樣品進行掃描成像，其中熒光信號通道選用 Alexa 594、488 和 DAPI，分別由 561 nm、493 nm 和 405 nm 的激發(fā)光激發(fā)。選擇 10×物鏡對背側和腹側海馬整體范圍成像，成像模式為 Tile-scan。采用 63×油鏡分別對背側海馬體 CA1 (dorsal CA1，dCA1)、腹側 CA1 (ventral CA1，vCA1)、背側 CA2 (dorsal CA2，dCA2)、腹側 CA2 (ventral CA2，vCA2)、背側 CA3 (dorsal CA3，dCA3)、腹側 CA3 (ventral CA3，vCA3)，以及背側 DG (dorsal DG，dDG)和腹側 DG (ventral DG，vDG)進行局部成像。

從每只動物的樣品中選擇 3～4 張與 dCA1、vCA1、dCA2、vCA2、dCA3、vCA3 以及 dDG 和 vDG 亞區(qū)相對應的圖像進行細胞計數(shù)。利用 ZEN(Zeiss)軟件，在腦片上圈畫出所需計數(shù)的目標區(qū)域，在 DAPI 標識的細胞核信號下，對該區(qū)域內所有的神經(jīng)元計數(shù)；在 Alexa 488 通道下，對綠色信號計數(shù)，即為該區(qū)域內 CB1R＋神經(jīng)細胞數(shù)目；在 Alexa 594 通道下，對紅色信號計數(shù)，即為該區(qū)域內 PV＋神經(jīng)細胞數(shù)目；在 Alexa 488 和 594 雙通道下，對黃色信號計數(shù)，即為該區(qū)域內 PV＋/CB1R＋神經(jīng)細胞數(shù)目。

2.6 統(tǒng)計與分析

采用 Microsoft Excel 2016 對單個樣品的數(shù)據(jù)進行處理，計算出 dCA1、vCA1、dCA2、vCA2、dCA3、vCA3 以及 dDG 和 vDG 8 個腦區(qū)中 PV＋、CB1R＋和 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元的分布密度，以及 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在 PV＋和 CB1R＋神經(jīng)元中的比例。所有組內及組間數(shù)據(jù)的分析在 GraphPad Prism 7.0 軟件中完成，以“平均值±標準誤差”表示，采用單因素方差分析方法分別統(tǒng)計分析每類神經(jīng)元在不同腦區(qū)中的分布密度和占比，以及雌雄數(shù)據(jù)之間的對比。

3 實驗結果

3.1 PV＋、CB1R＋ 和 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元在海馬體中的分布

研究報道小鼠背側及腹側 CA1、CA3 和 DG 上大量分布 PV＋神經(jīng)元[39]，而 CA1、CA2、CA3 的錐體細胞層和 DG 分子層的神經(jīng)元則表達較為豐富的 CB1R[15]，然而 PV 與 CB1R 是否表達在同一神經(jīng)元上并不清楚。為了更清楚地研究 PV＋神經(jīng)元和 CB1R＋神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是否共表達，本文使用 Cre 重組酶依賴的條件性基因打靶策略(圖 1)，構建了以 CB1R 為啟動子并使所有 CB1R＋細胞均表達綠色熒光蛋白的轉基因小鼠。

通過對小鼠海馬體組織切片進行免疫熒光染色和激光共聚焦成像發(fā)現(xiàn)，背側海馬體中 CB1R(圖 2(a)綠色熒光)和 PV(圖 2(a)紅色熒光)均有較高表達，且兩者存在一定共標(圖 2(a)黃色熒光)。對于腹側海馬體，結果與背側海馬體相似(圖 2(b))。定量結果顯示，背側和腹側海馬體中除分布較多 PV＋和 CB1R＋神經(jīng)元外，還表達有少量 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元(表 1)。整體來看，PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在 CA1 中的分布密度最高，CA2 和 CA3 次之，DG 中最低。這些結果提示，海馬體中 CB1R＋神經(jīng)元與 PV＋神經(jīng)元存在共標。

3.2 CB1R＋、PV＋ 和 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元在 CA1、CA2、CA3 和 DG 中的分布

圖 1 CB1R-iCre-EGFP 小鼠的基因表達載體結構示意圖Fig. 1 Schematic diagram of gene expression vector of CB1R-iCre-EGFP transgenic mouse

圖 2 海馬體中 CB1R＋、PV＋和 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元的分布Fig. 2 The distribution of CB1R＋, PV＋, and PV＋/CB1R＋ neurons within hippocampus

表 1 PV＋、CB1R＋ 和 PV＋/CB1R＋ 細胞在海馬體中的分布Table 1 The distribution of PV＋, CB1R＋, and PV＋/CB1R＋ cells within the hippocampus

考慮到低倍鏡下視野清晰度存在局限，為了進一步確認海馬體 CB1R＋神經(jīng)元與 PV＋神經(jīng)元的共表達，選擇分別對 CA1、CA2、CA3 和 DG 進行局部高倍成像。圖 3(a-d)顯示，高倍鏡下可以清晰地觀察到，海馬體四個亞區(qū)中少量的 CB1R＋神經(jīng)元上表達有 PV。從神經(jīng)元的分布密度來看，無論是雄鼠(圖 3(e))還是雌鼠(圖 3(g))，dCA1、vCA1、dCA2、vCA2、dCA3、vCA3、dDG 和 vDG 中均分布有少量 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元，其在 dCA1 中的分布密度最高，雌、雄分別為 153.48 cells/mm2和 207.60 cells/mm2；而在 dDG 中的分布密度較低，雌、雄分別為 50.32 cells/mm2和 59.47 cells/mm2。本研究進一步分析了 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在海馬體各亞區(qū) PV＋和 CB1R＋神經(jīng)元中的占比，發(fā)現(xiàn)雄鼠(圖 3(f))和雌鼠(圖 3(h))海馬體 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在 PV＋和 CB1R＋神經(jīng)元中所占的比例無顯著性差異。以上結果表明，海馬體內存在少量 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元，即海馬體部分神經(jīng)元同時表達 PV 與 CB1R。

3.3 CB1R＋、PV＋ 和 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元在海馬體中分布無雌雄差異

研究表明在發(fā)育過程中，性激素與 ECS 使大腦的結構和功能出現(xiàn)性別差異[45]，導致男、女性在某些神經(jīng)精神疾病的易感性和發(fā)病率方面表現(xiàn)不同[46]。CB1R 在發(fā)情期雌鼠前額葉皮層和杏仁核中的表達顯著低于雄鼠[47]。然而，PV＋、CB1R＋和 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在雌雄小鼠海馬體中的表達及分布是否存在差異尚不清楚?；诖耍疚姆謩e統(tǒng)計了雌、雄小鼠 PV＋、CB1R＋和 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在海馬體中的分布密度。本文作者課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，大腦皮層、隔核、海馬體、丘腦、下丘腦和腦橋等區(qū)域中 CB1R mRNA 表達水平在雌鼠不同生殖周期以及發(fā)情期與非發(fā)情期之間無顯著性差異[24]，因此本研究沒有特意區(qū)分雌鼠的生殖周期。統(tǒng)計結果顯示，dCA1、vCA1、dCA2、vCA2、dCA3、vCA3 以及 dDG 和 vDG 中 PV＋(圖 4(a))、CB1R＋(圖 4(b))和 PV＋/CB1R＋(圖 4(c))神經(jīng)元的表達密度均無雌雄差異。同樣地，雌雄小鼠 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在這些腦區(qū)的 CB1R＋神經(jīng)元(圖 4(d))和 PV＋神經(jīng)元(圖 4(e))中所占比例也無統(tǒng)計學差異。以上結果表明，PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在小鼠海馬體中的分布無雌雄差異，這可能與 ECS 在進化上的保守性有關[13]。

圖 3 CB1R＋、PV＋ 和 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元在 CA1、CA2、CA3 和 DG 中的分布Fig. 3 The distribution of CB1R＋, PV＋, and PV＋/CB1R＋ in the CA1, CA2, CA3, and DG

3.4 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元在 PV＋ 和 CB1R＋ 神經(jīng)元中的占比

圖 4 CB1R＋、PV＋ 和 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元在雌雄小鼠海馬體中的分布對比Fig. 4 The comparison of distribution of CB1R＋, PV＋, and PV＋/CB1R＋ neurons in the hippocampus between male and female mouse

上述結果證實，小鼠背側和腹側 CA1、CA2、CA3 及 DG 中部分神經(jīng)元共表達 PV 和 CB1R，且這些 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在海馬體中的分布無雌雄差異。那么，海馬體 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在 CB1R＋和 PV＋這兩類神經(jīng)元中所占的比例如何呢？為此，本文分別分析了小鼠海馬體 PV 在 CB1R＋神經(jīng)元和 CB1R 在 PV＋神經(jīng)元中的比例。結果顯示，dCA1、vCA1、dCA2、vCA2、dCA3、vCA3、dDG 和 vDG 中的 CB1R＋神經(jīng)元里都有少量表達 PV(圖 5(a))，平均表達量為 6.04%，CB1R＋神經(jīng)元內 PV 的表達情況在這些腦區(qū)之間無統(tǒng)計差異(圖 5(c))。同樣地，以上腦區(qū)中 PV＋神經(jīng)元里也都表達有 CB1R(圖 5(b))，平均表達量為 7.71%，且 PV＋神經(jīng)元內 CB1R 的表達情況在不同腦區(qū)之間無顯著性差異(圖 5(d))。該結果表明，PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在海馬體中呈現(xiàn)均勻分布的特征。

4 討 論

圖 5 海馬體 PV＋/CB1R＋ 神經(jīng)元在 PV＋ 和 CB1R＋ 神經(jīng)元中的占比Fig. 5 The ratio of the hippocampal PV＋/CB1R＋ neurons in PV＋ and CB1R＋ neurons

在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)遞質往往在結構和功能上相互作用，共同調節(jié)一系列生理過程和行為反應。其相互作用的方式之一就是這些信號分子的受體共表達在同一神經(jīng)元上。例如，CB1R 分布在表達有 CCK、GABA、多巴胺、5-羥色胺、谷氨酸、食欲素和生長激素抑制素等遞質受體的神經(jīng)元末梢上，當其與配體結合后，抑制突觸前膜的遞質釋放，參與調控疼痛、運動功能、麻醉與覺醒、學習記憶和情緒情感等?？梢哉f，CB1R 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演著“剎車”的角色，防止神經(jīng)元過度活躍。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還有一類具有相似效應的中間神經(jīng)元——PV 神經(jīng)元。PV 神經(jīng)元與其他亞型 GABA 能神經(jīng)元在腦內分布和生理功能等方面往往表現(xiàn)出不同特征。例如，CCK＋GABA 能神經(jīng)元在海馬體、內側前額葉皮層和腹側顳葉皮層等區(qū)域中高密度分布，放電模式溫和，并表達有 5-羥色胺III 型受體，參與調節(jié)焦慮抑郁等情緒。而 PV＋GABA 能神經(jīng)元作為腦內最主要的抑制性神經(jīng)元，廣泛分布在皮層和皮層下結構中，呈現(xiàn)出高頻快速放電模式，在伽瑪振蕩、神經(jīng)發(fā)生、情緒認知、多感覺注意、新物體識別、習得性行為和社交記憶的提取與消除以及精神疾病等方面發(fā)揮著重要的調控作用。所以，進一步全面地認識 PV 神經(jīng)元的結構和功能有助于我們更精準地理解上述各種生理和病理活動的發(fā)生機制。Pawelzik 等[43]發(fā)現(xiàn) CA1 中一類籃狀細胞表達 PV 和 μ-阿片肽受體，但不表達 CB1R、CCK 和 P 物質(Substance P)受體，而另一類籃狀細胞表達 CB1R、CCK 和 P 物質受體，但不表達 PV 和 μ-阿片肽受體。Katona 等[48]在電子顯微鏡下觀察到海馬體 CCK＋細胞的軸突末梢上分布有大量的 CB1R，而 PV＋細胞的軸突末梢上未見 CB1R。上述研究結果表明，PV＋GABA 能中間神經(jīng)元幾乎不表達 CB1R。由于之前的研究大部分都是在野生型小鼠上進行的，受標記 CB1R 技術手段的限制，CB1R＋神經(jīng)細胞的檢測靈敏度達不到實際需求。在本研究中，通過構建 CB1R-iCre-EGFP 的轉基因小鼠，所有表達 CB1R 的神經(jīng)細胞被標記上綠色熒光蛋白，這有利于更容易地在 CB1R 神經(jīng)元上觀察到 PV 的表達。本研究分別從定性和定量的角度發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬體的部分神經(jīng)元同時表達 PV 和 CB1R。此結果不但豐富了 CB1R＋神經(jīng)元的亞型，而且也可為證實 PV 與 CB1R 在功能上存在相互作用提供一定參考價值。

另外，大量研究表明許多精神疾病、情緒疾病以及行為障礙的發(fā)病率表現(xiàn)出性別差異。例如，雌性小鼠對與焦慮恐懼相關的情緒異常行為的易感性高于雄性小鼠，這與前額葉皮層 PV 神經(jīng)元活動的性別差異有一定關系[49-50]。性激素與 ECS 在發(fā)育過程中使大腦產生功能和結構上的性別差異，這種差異則會影響癲癇發(fā)作的區(qū)域敏感性以及在大腦中的傳播方式[45]。本文通過對組織切片進行免疫熒光染色和激光共聚焦成像發(fā)現(xiàn)，CB1R 在背側和腹側海馬體中均有大量表達，且 CB1R＋神經(jīng)元在這些區(qū)域中的分布沒有雌雄差異。本課題組前期的工作[24]也證實，小鼠運動皮層、內側韁核、下丘、背側海馬體以及 vCA2、vCA3 和 vDG 中 CB1R mRNA 的表達量也無雌雄差異。所以，本研究所展示的 CB1R 分布特點與前期的研究結果基本一致。進一步地，本研究還發(fā)現(xiàn) PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在小鼠海馬體背側和腹側 CA1、CA2、CA3 和 DG 腦區(qū)中的分布密度和比例也無雌雄差異，這可能與 ECS 在進化上的保守性有關。這些結果共同填補了全腦 CB1R 表達及分布模式的性別差異的空白，并有助于進一步開發(fā)和完善以 CB1R 為靶點的神經(jīng)精神類疾病的治療方案。

然而，本研究僅根據(jù)分子生物學方法來確定神經(jīng)元共表達，證據(jù)仍相對單薄。對于神經(jīng)元分類以及共表達，最準確的方法應該是綜合分子生物學、形態(tài)學、電生理以及單細胞測序等手段。鑒于 PV 神經(jīng)元具有明顯的吊燈樣和籃狀形態(tài)，以及具有快放電模式特征，可利用分子標志物標記 PV＋并表達 CB1R 的神經(jīng)元，再進行高分辨率光學顯微鏡或電子顯微鏡成像、電生理檢測、神經(jīng)遞質檢測以及單細胞測序，綜合多個不同水平的結果來共同確定該 CB1R＋神經(jīng)元是否為 PV 神經(jīng)元亞型。因此，未來的研究工作應該在跨尺度和多水平的層面上進行鑒別 CB1R 神經(jīng)元的類型，這將為 CB1R 神經(jīng)元分類提供一個更加準確和可靠的結果，也將有助于進一步探究內源性大麻素系統(tǒng)的精準調控作用。

5 結 論

本研究圍繞中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 CB1R＋神經(jīng)元是否表達 PV 這一問題展開。通過構建帶有綠色熒光報告蛋白的 CB1R-iCre-EGFP 轉基因小鼠，并借助免疫熒光染色方法和激光共聚焦顯微成像技術，結果顯示小鼠的背側和腹側 CA1、CA2、CA3 及 DG 部分神經(jīng)元存在 PV 和 CB1R 共表達，且這些 PV＋/CB1R＋神經(jīng)元在以上腦區(qū)中的分布密度和比例無雌雄差異。本研究結果提示海馬體中 PV 和 CB1R 在結構上存在相互作用，并可能為進一步闡明兩者在功能上的相互作用提供一定參考價值，同時為兩者在性別差異中的功能研究提供輔助證據(jù)。