郭寧，馮敏,王巍巍，張旭，孟軍，才笑寒，張曙光

(錦州市公安局刑偵支隊，遼寧 錦州 121000)

在法庭科學DNA檢驗中強奸案件是主要的一大類案件，這類案件給被害人造成巨大的心理及生理上的傷害，在這類案件偵破中生物物證的作用顯得尤其重要。目前在強奸案中有時會送檢孕早期的流產組織，來進行親權鑒定，鎖定犯罪嫌疑人。

本實驗室對收檢的典型案件中的孕早期流產組織進行檢驗，均能獲得完整的STR分型，為打擊罪犯提供了強有力的技術支持?，F(xiàn)結合本實驗的檢驗情況，對孕早期流產組織在法醫(yī)學中的檢驗及應用情況加以介紹。

1 孕早期流產組織檢驗的現(xiàn)狀

早期的破壞性流產胚胎組織中,母體成分與胚胎成分的有效分離,一直是檢驗的難題，分離不徹底，往往造成在擴增時母體成分DNA出現(xiàn)優(yōu)勢擴增，影響胚胎組織的STR分型結果。目前國內外關于孕早期胚胎組織的檢測研究主要集中在通過技術手段將母體組織和胚胎組織進行分離。常見的有手術刀片等手工顯微切割技術、細胞分離檢驗技術(LCM)等。這些方式均具有各自的優(yōu)缺點。

研究[1-2]表明，手術刀片等手工顯微切割技術可以在流產組織中成功分離胚胎成分。但是手工顯微切割技術需要操作人員具備足夠的經驗，操作也需要花費較長的時間，最主要的問題在于精度沒有保證，且不能完全將母體成分去除，不能避免母親成分對胚胎組織造成的污染。

LCM技術的發(fā)展在很大程度上解決了以上問題。通過LCM技術可以從流產的絨毛膜組織、胚胎組織、母體蛻膜組織、母體血液等混合組織中獲得胚胎細胞,盡量避免母體成分的干擾,通過捕獲200個絨毛細胞獲得胚胎成分的DNA分型[3]。Bauer等[4]在2002年，首次將LCM技術應用于法庭科學中的孕早期流產胚胎組織的檢驗。他們利用LCM技術從流產組織中直接分離得到絨毛細胞，最大限度的去除母體成分的污染，成功獲得單一的胚胎成分的STR分型進而準確進行親權鑒定，但LCM技術在法醫(yī)學領域的應用并不廣泛。

本文采用的是最簡單、最能在基層法醫(yī)單位開展應用的方法，肉眼直接觀察區(qū)分、水中直接剪取絨毛。該方法能夠得以成功是利用了胚胎組織發(fā)育過程中胎膜和絨毛膜不同的形態(tài)特征。胚胎組織在6 w之后已經形成了的胎膜，完整的胎膜和胚胎呈現(xiàn)卵圓形，胎膜外側的絨毛膜已經分化成三級絨毛[5]，在水中，絨毛膜分化的三級絨毛較子宮基蛻膜的絨毛長，并呈密集三級分叉的珊瑚狀結構，母體的子宮內壁基蛻膜碎片的形狀不規(guī)則，顏色多呈米白色或淺褐色，基蛻膜和其上的絨毛樣結構顏色較胎膜和胚胎組織稍深，成短簇的絨毛態(tài)，不分叉[6]。在水中漂浮時，絨毛完全展開的狀態(tài)下，在結構上可以明顯的區(qū)分出來絨毛組織。對絨毛組織進行DNA檢驗，可以獲得胚胎的STR分型。利用該方法在法醫(yī)實際工作中對孕早期流產組織的檢驗有成功的報道[6]83-84。

2 孕早期流產組織DNA檢驗在法醫(yī)學中的應用

2.1 經典案例

2.1.1 案例

案例一：2018年10月22日20時47分，某派出所接“110”指令，報警人稱其被人強奸。出警到達指定地點，據被害人(14周歲)申某述稱：自己于2018年8月中旬一天，在劉某家中被其強奸。

案例二：2018年12月24日12時52分，石某某報警稱：2018年11月1日7時至2018年11月30日18時期間，其被一個叫張某某的人以“上網吧上網”為由帶到北鎮(zhèn)市青堆子鎮(zhèn)六屯村550號北小橋南側草苫堆邊上，被張某某強奸。

兩起案件報案時均距離案發(fā)時間較長，被害人均記不清具體的發(fā)案時間，精斑等已經不具備檢驗條件，故送檢冷凍的被害人流產組織。

2.1.2 檢驗過程及檢驗結果

將冷凍的流產組織放置在無陽光直射處、室溫解凍，待流產組織解凍后將其置于經過消毒的廣口玻璃器皿中用超純水反復沖洗，清洗時要用小水流，小心翻動，盡量洗凈母體血液和組織[7]。沖洗至液體澄清無血色。

將沖洗干凈的流產組織放置于面積較大的潔凈容器中，加入能沒過其的超純水，用鑷子將流產組織完全展開，使其漂浮在水中?？梢钥匆娀野咨q毛浮在水面上，直接在水中剪取胚胎組織絨毛膜 1～2 mm，放置于0.6 mL的EP管中。用行標GA/T 383-2014中的聚苯乙烯二乙烯基苯樹脂法(Chelex 100法)提取其DNA。

采用Promega PowerPlex21試劑盒進行PCR復合擴增；擴增產物經ABI-3130XL型DNA序列分析儀電泳分離和激光掃描分析，得到各檢材的STR分型結果如下，見表1、表2。

表1 案例一送檢的檢材STR分型結果

表2 案例二送檢檢材的STR分型結果

2.1.3 結果分析與討論

這兩起案件均檢出了流產組織、被害人及嫌疑人的STR分型結果。而且均符合生物學遺傳規(guī)律，都能夠為案件的偵破提供強有力的依據。

這兩起案件檢驗成功的關鍵在檢材的提取上，孕早期流產的胚胎組織，一般都是在醫(yī)院進行流產后由辦案民警送檢。所以送檢人要在提取后及時送檢，正確保存，否則檢材被破壞，會加大檢驗難度，甚至喪失檢驗條件。

送檢的孕早期流產胚胎組織往往包含大量的血性液體，因此提取絨毛之前，一定要反復用超純水清洗送檢的流產組織，力爭去除母體血液對胚胎組織的污染。

由于絨毛的DNA含量非常豐富，較常規(guī)物證用量要小很多。因此在擴增時要把握好模板的量、在電泳時要注意加樣的量，以免造成等位基因峰高過高，不能獲得滿意的結果。

2.2 孕早期流產組織DNA檢驗在法醫(yī)學中的應用

孕早期流產組織DNA檢驗在法庭科學中有著重要的意義。在強奸案件中，有沒有性行為是主要的定罪環(huán)節(jié)，有時候犯罪嫌疑人會狡辯稱在床單或者衛(wèi)生紙上留下的精斑是其自慰產生的，并不存在性行為，往往給定案造成一定的困擾，但是如果流產的胚胎組織與嫌疑人具有生物學的親緣關系，嫌疑人就失去狡辯的機會。而且一旦送檢的是孕早期流產組織，這類強奸案往往是由于被害人自己疏忽、智力障礙或者被脅迫等原因，不敢或羞于報案，直到其親屬或者監(jiān)護人發(fā)現(xiàn)異常時詢問才會得知其被性侵的經歷，但由于距離案發(fā)時間久遠，精斑等體液類的生物物證基本已經失去檢驗條件，因此孕早期的流產組織成為關鍵且唯一的證據，也是唯一的希望。

由于孕早期流產組織的重要性，因此在提取、送檢及檢驗過程中要謹慎。首先，在法庭科學日常檢案過程中送檢的早期胚胎組織通常為藥流和人流兩種不同方式產生的流產組織。送檢時有著不同的要求，藥物流產的需要送檢全部的陰道排出物；而人工流產，需要送檢手術中產生的所有固態(tài)物質。其次，在被害人去醫(yī)院進行流產前，送檢單位必須提前和就診的醫(yī)院、醫(yī)生進行溝通，盡可能采取適當?shù)牧鳟a方式，以保證提取到的孕早期流產組織盡可能的完整、唯一、避免胚胎組織和別的個體的流產組織相互混淆。為了防止污染，提取時需要用消毒后的潔凈容器，提取全部的固體組織。再次，在送檢人接到需要送檢的流產組織時，要及時送檢，這是由于孕早期流產組織含有大量的血性液體，容易發(fā)生腐敗進而影響之后的DNA檢驗。如果實在由于特殊原因不能在第一時間送檢時必須要冷凍保存，不能采取福爾馬林固定。因為有研究[8-9]表明，福爾馬林固定后的檢材，由于在其生物大分子之間存在較多的亞甲基交聯(lián)橋，增加了DNA分子的脆性，而且DNA與蛋白質形成較為牢固的復合體，不利于提取固定組織中的DNA。最后，提取到的孕早期流產組織均要求獨立包裝，在包裝袋上寫明案件名稱、提取時間、送檢人等信息，并且給其賦予唯一性標識，必要時需要拍照固定其原始的形態(tài)特征。

DNA室檢驗人員接到送檢的孕早期流產組織后要立刻進行檢驗，如果不能及時檢驗需要繼續(xù)冰凍保存。檢驗前要對檢材進行預處理，首先室溫解凍，解凍后用超純水反復沖洗，以期盡可能多的去除流產組織中的血性液體，減少母體成分的污染。在沖洗過程中要小心輕柔，以防將絨毛組織沖掉，影響之后的提取。絨毛組織的提取采取的是水中直接剪取法，絨毛組織的形態(tài)在水中比較好辨認。三級絨毛就是孕早期流產胚胎組織檢出STR分型的關鍵物證。但是需要注意的是有一部分孕早期的流產組織是手術切除的輸卵管妊娠組織，由于懷孕時間短，胚胎很小，肉眼無法將胎兒和母體組織區(qū)分開來，這種情況下可以進行病理切片后借助光學顯微鏡，有針對性地選取所需要的胎兒絨毛組織[10]。也可以采取分段提取的方式，多剪取幾處送檢的輸卵管組織，分別進行檢驗，可以獲得成功的分型。

孕早期流產組織在法庭科學DNA檢驗中是一類常見但并不常規(guī)的檢材，有些基層檢驗單位不具備檢驗條件，而且由于人力、物力、財力的限制，造成手術刀片等手工顯微切割技術、細胞分離檢驗技術(laser capture microdissec-tion,LCM)不能在基層法醫(yī)檢驗單位廣泛的應用。因此這種肉眼直接觀察區(qū)分、水中直接剪取絨毛的方法較為直接、簡單、便于推廣。但是這種方法需要檢驗人員有足夠的經驗，可以區(qū)分出絨毛組織，因此基層的法醫(yī)單位要對人員進行培訓，提高檢驗人員的技術水平，讓孕早期流產組織的檢驗更好的發(fā)揮作用，為偵查破案、打擊犯罪提供更有力的技術支持。