曾麟雅，賴 爽，曾英杰，肖 力

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610072)

牙再生是口腔科學中的研究熱點，其中牙周膜再生作為牙再生中的難點和重點受到廣泛關注。大量研究表明[1，2]，保持或者重新獲得牙周膜細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)的活性，是牙周膜成功再生的關鍵?；|(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是一類具有趨化作用的小分子蛋白，對BMSCs和PDLSCs都有趨化作用[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)[4]，堿性成纖維細胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可以促進再植牙形成新的牙周膜纖維，并在防止再植牙骨性粘連和牙根吸收方面有一定作用。2018年6月至2019年5月本實驗采用MTT法，初步研究SDF-1和bFGF對比格犬BMSCs增殖的影響，探討兩種因子對比格犬BMSCs增殖影響的最佳濃度，并利用RT-PCR檢測成骨、成纖維相關因子以及趨化相關基因的表達，為進一步研究利用BMSCs促進牙周膜再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，USA)；胎牛血清(Hyclone，USA)；MTT溶液(Sigma，USA)；CO2恒溫孵箱(MCO-15AC型，Sanyo electric，Japan)；倒置相差顯微鏡及照像系統(tǒng)(IX70-S8F2型，Olympus optical，Japan)；全自動定量繪圖酶標儀(Varioskanflash3001-1275，Thermo，USA；BestarTM qPCR RT kit(DBI Bioscience，China)。

1.2 方法

1.2.1比格犬BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定和分化原代培養(yǎng)及純化 選取18～24個月齡雄性體健比格犬，全麻下行骨髓穿刺，獲得比格犬髂骨骨髓，并以差別貼壁法加以純化；傳代培養(yǎng)待原代P0細胞貼壁融合達80%～90%時，以1∶2的比例傳代培養(yǎng)得到第一代(P1)細胞。用P2～P4細胞進行實驗。消化收集P2～P4比格犬BMSCs，制成5×106/ml的單細胞懸液，分為100 μl每管，加入抗犬CD29、CD34、CD44、CD45抗體并充分混勻，鑒定流式細胞學檢測表面抗原標志物CD34、CD29 、CD44及CD45的表達。同時，消化收集P2～P4比格犬骨髓干細胞，將細胞密度調(diào)整為6×104/ml，用微量加樣槍小心滴加細胞懸液于6孔板上，每孔接種500 μl，分為成骨誘導組，成脂誘導組和對照組；接種24 h后，成骨誘導組每孔加入2 ml成骨誘導培養(yǎng)基，對照組仍加完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵箱培養(yǎng)，誘導20 d后茜素紅染液，倒置相差顯微鏡下觀察并采圖。成脂誘導為接種72 h后加入2 ml成脂誘導培養(yǎng)基，對照組仍加完全培養(yǎng)基，誘導14天后油紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.2MTT檢測不同濃度SDF-1和bFGF分別對BMSCs的增殖作用 收集P2～P4比格犬BMSCs，調(diào)整細胞密度為1×107/ml，滴加細胞懸液于96孔板上，每孔接種2 μl，于CO2孵箱培養(yǎng)，分別加入不同濃度的SDF-1 (100、200、300 ng/ml)與bFGF(20、50、100 ng/ml)進行干預。于培養(yǎng)的1、3、5、7 d，每天同一時間收集樣本(n=10)進行MTT比色實驗。選570 nm波長，在全自動酶標儀上測定各孔光吸收(OD)值。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.3MTT檢測最佳濃度時SDF-1和bFGF對BMSCs增殖作用 實驗步驟同上，實驗分組為空白對照組(未加入任何細胞因子)和實驗組(加入最佳濃度的SDF-1和bFGF)。

1.2.4RT-PCR檢測成骨、成纖維相關因子以及趨化相關基因的表達 取生長狀態(tài)良好的P2～P4代比格犬BMSCs，將細胞分為三組，即空白對照組、SDF-1組(培養(yǎng)基中加入最佳濃度SDF-1)和bFGF組(培養(yǎng)基中加入最佳濃度bFGF)，培養(yǎng)5天后，提取細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，然后進行實時定量PCR反應，檢測堿性磷酸酶(ALP)、I型膠原、Ⅲ型膠原蛋白、C-X-C家族趨化因子受體4(CXCR4)以及S100A4等基因表達的差異。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間的比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察原代培養(yǎng)24小時后可見貼壁細胞數(shù)量較少，細胞成集落樣生長，部分細胞貼壁呈多角形或類圓形。5天以后，細胞成片生長并相互融合。見圖1。

圖1 BMSCs形態(tài)(×40) a：1天后；b：5天后

2.2 細胞表型鑒定流式細胞儀檢測結果顯示原代培養(yǎng)的P3代比格犬BMSCs表面抗原表達CD29(+)(84.33%)，CD44(+)(57.11%)，CD34(-)(2.87%)，CD45(-)(0.96%)，見圖2。

圖2 比格犬BMSCs表面標記流式鑒定圖 a：CD29抗原；b：CD44抗原；c：CD34抗原；d：CD45抗原

2.3 成骨成脂誘導染色成骨誘導20 d后，顯微鏡下觀察，可見誘導組的貼壁細胞形成網(wǎng)狀結構，生長密集，局部細胞放射狀聚集成團，形成多個大小不等的圓形礦化結節(jié)。茜素紅染色后，見礦化結節(jié)呈紅色，不透明，部分礦化結節(jié)之間相互融合成片。成脂誘導10 d后便可發(fā)現(xiàn)部分細胞變得肥大且胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴，為折光度較強的圓形小泡。14 d時，大部分細胞變形，內(nèi)含脂滴。油紅O染色可見，脂滴紅染。見圖3。

圖3 BMSCs成骨成脂誘導染色結果(×100) a：茜素紅染色；b：油紅O染色

2.4 不同濃度SDF-1和bFGF分別對BMSC的增殖作用bFGF在20、50、100 ng/ml時對BMSCs均有促進作用，在50 ng/ml時，達到峰值，在100 ng/ml時，對細胞增殖的促進作用降低。所以我們選擇50 ng/ml作為最佳濃度。100、200、300 ng/ml的SDF-1對BMSCs均有促進作用，且200、300 ng/ml的效果更為顯著，達一定濃度后，SDF-1濃度的增加對于細胞的增殖不具有顯著效果。因此，選擇200 ng/ml作為最佳濃度。見圖4、圖5。

圖4 不同濃度bFGF對BMSCs的增殖作用 *P < 0.5，**P < 0.01，***P < 0.001)

圖5 不同濃度SDF-1對BMSCs的增殖作用 *P < 0.5，**P < 0.01，***P < 0.001)

2.5 最佳濃度時SDF-1和bFGF對BMSCs增殖作用在加入了最佳濃度SDF-1和bFGF的組別中，相對于空白對照組來說，細胞增殖明顯，但是細胞的生長周期類似。見圖6。

圖6 SDF-1和bFGF最佳濃度時對BMSCs增殖作用

2.6 SDF-1和bFGF對目的基因表達的影響SDF-1和bFGF都可以顯著增加Ⅰ型膠原的表達；而對于Ⅲ型膠原來說，bFGF對其的表達上升比SDF-1的作用更為明顯；bFGF可以抑制ALP的表達，而SDF-1對ALP的表達沒有影響；SDF-1和bFGF都可以增加S100A4的表達，但bFGF對其的影響更為顯著；SDF-能夠增加CXCR4的表達，但是bFGF對其沒有作用。見圖7。

圖7 SDF-1和bFGF對目的基因表達的影響 a：Ⅰ型膠原；b：Ⅲ型膠原；c：S100A4；d：ALP；e：CXCR4 *P < 0.5，**P < 0.01，***P < 0.001)

3 討論

牙齒再生是口腔科學中的研究熱點，大量研究表明，牙周膜被破壞后極易喪失抗感染以及自我修復和更新的能力，這也是牙周膜再生異常困難的重要原因。近年來，牙周膜干細胞(PDLSCs)修復牙周缺損的作用已被證實[5]，但距離真正的臨床推廣應用仍有一定差距，其主要原因是PDLSCs的獲取相對困難，難以滿足臨床治療需求；而BMSCs的獲得相對更加便捷，培養(yǎng)方法也簡單成熟。近年來，關于BMSCs的研究越發(fā)成熟，大量體內(nèi)外實驗表明[6，7]，部分細胞因子可以通過影響B(tài)MSCs移植的微環(huán)境，進一步影響B(tài)MSCs的動員、遷移及分化。近期研究發(fā)現(xiàn)[8，9]，通過局部直接注射、動靜脈移植等途徑植入同種異體或異種MSCs后，受者體內(nèi)并未發(fā)生免疫排斥，這一結果提示BMSCs可能具有特殊的免疫學特征。

SDF-1是一類對細胞有趨化作用的小分子蛋白質(zhì)，可促進細胞Ⅰ型膠原基因表達上調(diào)，刺激BMSCs的增殖。此外，Kim的團隊利用SDF-1的趨化作用，在未植入種子細胞的小鼠牙槽窩內(nèi)，植入了具有牙齒外形并復合SDF-1的生物材料，結果顯示有類似牙齒的結構再生[10]。bFGF是一種應用廣泛、功能多樣的細胞因子，對細胞生長、增殖、分化等都有著重要的調(diào)節(jié)作用。目前大多數(shù)學者認為[11]，bFGF作用于骨髓基質(zhì)細胞分化增殖的早期，促進骨髓基質(zhì)細胞分裂增殖，增加細胞數(shù)量，此外，bFGF能在提高BMSCs增殖速度和壽命的同時，保持其多分化潛能。本實驗結果提示，在一定濃度內(nèi)，SDF-1和bFGF濃度的增加有助于細胞的增殖，但到達一定濃度后，其濃度的增加對于細胞的增殖無顯著效果，這一現(xiàn)象可能與受體減少或細胞轉化通道的阻滯有關[12]。

一系列研究顯示，存在的一些蛋白分子包括S100A4、以及Ⅲ型膠原等生物活性物質(zhì)均具有抑制礦化的作用，可能參與維持牙周膜結構和功能的穩(wěn)定[13]。CXCR4是SDF-1唯一作用的趨化受體，如果表達增加，那么SDF-1對該細胞的趨化作用增強。從結果看來，SDF-1和bFGF能夠不同程度的刺激Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和S100A4的表達。我們知道，Ⅰ型膠原是牙周膜纖維中最主要的成分之一，而Ⅲ型膠原與S100A4能阻止礦化基質(zhì)的沉積，可能對維持正常牙周膜間隙不被礦化有一定的作用，因此體外實驗可以證明BMSCs在SDF-1和bFGF的刺激下，可能朝著牙周膜纖維細胞方向分化并且使相關的抑制礦化的基因和蛋白表達增加，這就為我們下一步在體內(nèi)實驗中使用SDF-1和bFGF來促進BMSCs向牙周膜成纖維細胞分化、從而促進牙周再生提供了一個有力的支持和證據(jù)。綜上所述，我們推測，SDF-1和bFGF將會對BMSCs介導的牙周膜組織再生工程產(chǎn)生積極作用，而對于兩種因子作用下分子機制的研究還需要更深入細致的探討。