劉應(yīng)芬，余昌秀，曹 玲，李青峰

(成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心檢驗(yàn)科，四川 成都 610016)

2019年12月以來，湖北省武漢市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多例新型冠狀病毒(2019-nCoV)的肺炎患者，隨著疫情的發(fā)展，新型冠狀病毒引起了全中國乃至全世界的高度關(guān)注[1]。目前對2019-nCoV診斷起決定作用的任然是病毒核酸檢測分析[2]。然而，目前核酸檢測假陰性率仍然較高。假陰性的原因從檢測方面分析可能在于以下幾個方面，首先與試劑盒的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性相關(guān)，其次，試劑盒的質(zhì)量有待進(jìn)一步提高[3，4]。核酸檢測主要分為兩個步驟進(jìn)行即核酸提取和核酸擴(kuò)增。本研究擬通過對核酸提取試劑與擴(kuò)增試劑是否匹配的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，評價試劑匹配與否的優(yōu)劣，供實(shí)驗(yàn)室參考，盡可能降低核酸檢測的假陰性率。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集本院2020年2月19日當(dāng)天23例疑似和確診新冠患者的的咽拭子標(biāo)本。

1.2 方法RNA的提取：分別采用達(dá)安全自動提取儀(提取試劑批號2019003，磁珠法)和圣湘手工RNA提取試劑(批號2020002，磁珠法)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行提取。核酸擴(kuò)增：按儀器使用說明或標(biāo)準(zhǔn)操作程序操作。達(dá)安：通道設(shè)置為通道1：FAM； 通道2：HEX； 通道3：TREA-RE；通道4：CY5，循環(huán)程序50 ℃15分鐘；95 ℃15分鐘，94 ℃15秒—55 ℃45秒45個循環(huán)；熒光收集在55 ℃。圣湘：通道設(shè)置為通道1：FAM； 通道2：HEX； 3：ROX，循環(huán)程序如下：50 ℃30分鐘；95 ℃1分鐘，95 ℃15秒—60 ℃30秒45個循環(huán)，25 ℃10秒冷卻；熒光收集在60 ℃。

1.3 結(jié)果判讀達(dá)安擴(kuò)增試劑：如果檢測樣品在FAM通道和HEX通道無明顯擴(kuò)增曲線或CT值>38，可判讀為2019-nCoV陰性；如果檢測樣品在FAM通道和HEX通道CT值≤38，且曲線有明顯的擴(kuò)增曲線，可判讀為2019-nCoV陽性。圣湘擴(kuò)增試劑：如果檢測樣品在FAM通道且ROX通道無明顯擴(kuò)增曲線或CT值》40，HEX通道有擴(kuò)增曲線，檢測CT值≤40，可判讀為2019-nCoV陰性；如果檢測樣品在FAM通道或ROX通道CT值≤40，且曲線有明顯的擴(kuò)增曲線，可判讀為2019-nCoV陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行分析，通過計(jì)算各組合核酸檢出率來分析不同試劑組合的差異。率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種試劑的基本資料達(dá)安試劑(A)和圣湘試劑(B)兩種試劑的基本情況見表1。兩種試劑中的RNA提取均采用磁珠提取法，檢測基因均為ORF1ab和N基因。

表1 兩種試劑的基本情況

2.2 檢測結(jié)果分析不同試劑匹配的檢測結(jié)果見表2和表3。用A提取的23份RNA加入A擴(kuò)增試劑進(jìn)行檢測，得到7例新冠核酸陽性，檢出率為30.43%；用B提取的RNA加入A擴(kuò)增試劑進(jìn)行檢測，得到4例新冠核酸陽性，檢出率為17.39%。用A提取的23份RNA加入B擴(kuò)增試劑進(jìn)行檢測，得到4例新冠核酸陽性，檢出率為17.39%；用B提取的RNA加入B擴(kuò)增試劑進(jìn)行檢測，得到8例新冠核酸陽性，檢出率為34.78%。匹配的試劑組檢出率高于交叉組。

表2 A擴(kuò)增試劑的檢測結(jié)果

表3 B擴(kuò)增試劑的檢測結(jié)果

3 討論

本研究比較了兩個公司的核酸提取試劑與核酸擴(kuò)增試劑的匹配與否的檢測結(jié)果，結(jié)果顯示兩個公司自己的提取試劑匹配自己的擴(kuò)增試劑檢測ORF1ab、N基因的檢出率高于核酸提取試劑與擴(kuò)增試劑交叉檢測率。

對于新型冠狀病毒的檢測，我們嚴(yán)格按照中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南(第三版)》對23例可疑和確診患者的咽拭子樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明兩家公司的試劑均可以檢測出ORF1ab基因和N基因，但是核酸提取試劑與核酸擴(kuò)增試劑匹配不同，檢出率是有差異的。這種差異的原因之一可能與試劑引物設(shè)計(jì)有關(guān)，又一原因可能是各試劑盒受樣本本身的來源及其質(zhì)量、樣本轉(zhuǎn)運(yùn)條件、樣本預(yù)處理的影響不同而引起差異[5～7]。

新冠肺炎疫情是突發(fā)的公共衛(wèi)生事件，各試劑廠商都是在極短的時間內(nèi)完成試劑盒的研發(fā)和審批，試劑盒的質(zhì)量和一些性能參數(shù)設(shè)置難免有不足之處，這對我們實(shí)驗(yàn)室就要求更加嚴(yán)格的質(zhì)量控制。各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身情況，盡可能選擇能提高核酸檢出率的試劑盒，為臨床診斷治療提供更加可靠的依據(jù)。